СПОСОБ ОЧИСТКИ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА Российский патент 1994 года по МПК C07K1/12 C07K3/28 C12P21/06 

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для повышения степени гомогенности коммерческих препаратов бычьего сывороточного альбумина (БСА).

БСА широко применяют в биохимической и иммунологической практике с целью подавления неспецифической адсорбции антител, для стабилизации антигенов, в качестве белка-маркера и т.п. Чистота используемого альбумина, определяемая степенью его гомогенности, является одним из факторов, влияющих на качество проводимых исследований.

В настоящее время для выделения БСА из плазмы используют следующие основные способы: высаливание неорганическими солями (обычно сульфатом аммония), осаждение органическими растворителя при пониженной температуре, избирательная денатурация с последующим осаждением посторонних протеинов. Дальнейшую очистку альбумина с целью повышения степени его гомогенности осуществляют, используя методы препаративного электрофореза, гель-фильтрации, хроматографии, в том числе аффинной и др.

Целью изобретения является дополнительная очистка коммерческих препаратов БСА, первоначально выделенных из плазмы, что достигается ферментативным протеолизом посторонних белков с помощью трипсина с последующим разделением альбумина, трипсина и продуктов протеолиза на сефадексе.

Сущность заявленного способа дополнительной очистки БСА заключается в том, что к 1-3% раствору альбумина в 01, М бикарбонатном буфере (рН 7,8) добавляют кристаллический трипсин (или эквивалентное по активности количество аморфного трипсина), исходя из соотношения белок:фермент, равном 50:1, выдерживают при 37^оС 1 ч и затем раствор пропускают через колонку с сефадексом, при этом альбумин (М=69000) выходит из колонки раньше, чем трипсин (М= 21000) и продукты протеолиза. При необходимости получения белка в свободном состоянии проводят диализ для удаления солей и лиофильную осушку. При выборе оптимальных условий проведения протеолиза (концентрация, температура, рН) руководствуются апробированными данными.

Для контроля за степенью чистоты альбумина выполняли диск-электрофорез белкового раствора в полиакриламидном геле на приборе ПЭФА-1 до и после протеолиза. Значения рН разделяющего геля и буферного раствора составляли 8,9 и 8,3 соответственно, окрашивание белковых зон в геле осуществляли красителем амидо-черным. Следует отметить, что при указанных значениях рН молекулы трипсина заряжены положительно (изоэлектрическая точка 10,5) и мигрировать в геле к положительному электроду не будут, что исключает влияние фермента на результаты электрофореза.

На чертеже представлены электрофореграммы исходного препарата БСА (а) и белка, подвергшегося воздействию трипсина (б).

Как видно, в результате обработки ферментом достигается существенное повышение степени гомогенности белкового препарата.

Для сравнения предложенного способа гомогенизации БСА с ранее известными была выполнена тепловая денатурация посторонних белков, для чего 1%-ный раствор альбумина в дистиллированной воде инкубировали при 70^оС до появления легкого помутнения, фильтровали и проводили электрофорез. Как видно из электрофореграммы, представленной на чертеже (в), полного удаления посторонних протеинов достичь не удалось, вместе с тем уменьшается интенсивность белковой зоны альбумина, что свидетельствует о частичной потере полезного компонента.

Пример конкретной процедуры очистки коммерческого препарата бычьего сывороточного альбумина.

Оборудование:
1. Термостат лабораторный. 2. Прибор для электрофореза ПЭФА-1, ТУ 5-375-4231-77. 3. Стеклянная колонка l=50 см, d=1 см с сефадексом G=75 (LКВ, Швеция).

Реактивы и материалы: 1. БСА марки Б производства Олайнского завода, ТУ 6-09-10-342-75. 2. Трипсин производства Ленинградского мясокомбината. 3. 0,1 М бикарбонатный буфер, рН 7,8. 4. Набор реактивов для проведения диск-электрофореза (по паспорту к прибору ПЭФА-1).

Ход выполнения процедуры: 1 г БСА растворяют в 100 мл бикарбонатного буфера, фильтруют для удаления осадка. Отбирают пробу раствора белка и выполняют диск-электрофорез в соответствии с методикой, приведенной в паспорте на прибор ПЭФА-1 (3), электрофореграмма исходного раствора БСА приведена на чертеже (а). К раствору БСА добавляют 20 мг трипсина, перемешивают и выдерживают в термостате при 37^оС в течение 1 ч. Повторяют электрофорез, результаты приведены на чертеже (б). Для отделения трипсина и продуктов протеолиза раствор пропускают через колонку с сефадексом, фракция очищенного альбумина выходит из колонки первой.

Технико-экономическая или иная эффективность. Предлагаемый способ дополнительной очистки белка является эффективным средством гомогенизации коммерческих препаратов бычьего сывороточного альбумина.

Использование: биохимия, биотехнология. Сущность: бычий сывороточный альбумин (БСА) выделяют из плазмы путем осаждения этанолом, изменения рН, ионной силы. Дополнительно проводят протеолиз примесных белков с помощью трипсина в бикарбонатном буфере, рН 7, 8. БСА отделяют гельфильтрацией на сефадексе G=75. 1 ил.

СПОСОБ ОЧИСТКИ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА, включающий осаждение плазмы этанолом при низкой температуре, изменение рН, ионной силы, удаление посторонних белков, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют протеолиз примесных белков с помощью трипсина в бикарбонатном буфере, рН 7,8, при 37^oС и отделяют бычий сывороточный альбумин путем гельфильтрации через сефадекс G-75.