Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к интерлейкину-2 человека Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

31472499

напором среду. Клеточную суспенныв а в о в 10

зию переносят в пробирку и позволяют неразбившимся комочкам клеток рсесть в течение 2-3 мин. Клеточную суспензию декантируют в другую пробирку и центрифугируют (200 xg, 10 мин) при комнатной температуре. Затем 30X10 селезеносных клеток мыши и 6 «10 миеломных клеток )бЗ Ag 8 653

смешивают в пробирке и промывают средой RPMI-1640t Надосадочную жидкость осторожно удаляют и при помешивании к клеточному осадку медленно, по каплям, в течение 30 с добавдяют 1 мл |5 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 4000 с 10% по объему диметилсульфок- сида в среде RPMI-1640, Через одну минуту для разбавления полиэтилен- гликоля по каплям приливают 10 мл 20 KPMI 1640, Клетки оставляют на 10 мин при комнатной температуре, затем цен-; трифугируют (200 xg, 10 мин). Надосадочную жидкость декантируют, к осадку добавляют 40 мл RPMI 1640, со- 25 держащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), суспендируют клетки пипетированием и клеточную суспензию распределяют в четыре 96-луночные плашки, в которые за день до слияния 30 высаживают мышиные перитонеальные клетки (5/10 клеток на лунку). На следу-I ющий день в лунки плашки вносят по 100 мкл среды, содержащей М

Концентрация специфических иммуно глобулинов в культуральной жидкости более 75 мкг/мл, в асцитной жидкое-, ти - 5 - 10 мг/мл.

Характеристика полученного продук та. Штамм продуцирует Ig G субкласса 2Ь, В твердофазном иммуноферментном анализе антитела взаимодействуют с препаратами IL 2 из линии .Jurkat, рекомбинантного IL 2 и синтетическим пептидом,соответствующим последова- ..тельности аминокислот 59-72 интерлей кина 2 человека.

Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 25 пас сажей в культуре,

Криоконсервирование,

Среда для замораживания - 90% ЭТС 10% ДМСО, Плотность клеток к10 кл/мл. Ампулы с клетками в пенопластовой коробке вьщерживают при минус - 70°С в течение суток и переносят в дюары с жидким азотом. Режим

о

гипоксантина, 8х10 М 3,2к10 М тимидина. Клоны гибридных клеток становятся заметными через 7- 10 дней. Тестирование клонов проводят, когда клетки заполняют лунку на 20%, Положительные культуры клонируют методом лимитирующих разведений при плотности 0,1-1 Клетка на лунку.

Полученный штамм обозначен ЛНКБ-2„ Он депонирован под номером ВСКК(П) № 128Д и характеризуется следунщими признаками,

Культуральные признаки,

Стандартные условия культивирования: среда RPMI-1640, 300 мг/мл L- глютамина, 10% ЭТС, М меркап- тоэтанола. Температура ,

При суспензионном культивировании клетки слабо прикреплены к субстрату или располагаются свободно. При посевной плотности 1 кл/мл через 3-5 дней плотность достигает З кл/мл. Кратность рассева 5-.. Ш раз.

отогрева - водяная баня при 37 С,

аминоптерина и эс Жизнеспособность клеток после крио- . консервирования 40% по окрашиванию с трипановым синим.

40

45

50

55

Контаминация, Контаминации отсутствуют.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1, Йммуноферментный . анализ моноклональных антител ЛНКБ-2

Образцы, содержащие антитела (су- пернатанты клеточных культур или ас- цитная жидкость), тестируют методом .твердофазного иммуноферментного анализа по связыванию с препаратами IL 2 из клеточной линии Jurkat (удельная активность 8, ед,/мг белка), рекомбинантного IL 2, пептидом, соответствукщим последовательности аминокислот 59-72 IL 2 человека, В л унки 96-луночной планки вносят препарат IL 2 (50 нг на лунку) или пептид (500 нг/лунку) в 0,05 М -бикарбонатном буфере рН 9,6 и остав- -пяют на 18 ч при 4 С, Плашку отмыва50 5 0

Культивирование в организме животных. Гибридные клетки прививают и выращивают в виде асцита в пбритоне- альной полости мышей линии BALB/c, За 7 дней до введения клеток мышам вводят по 0,5 мл пристана. Асцит образуется через 10-14 дней после введения 2-5 млн, клеток, 0 Продуктивность штамма.

Концентрация специфических иммуноглобулинов в культуральной жидкости более 75 мкг/мл, в асцитной жидкое-, ти - 5 - 10 мг/мл.

Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует Ig G субкласса 2Ь, В твердофазном иммуноферментном анализе антитела взаимодействуют с препаратами IL 2 из линии .Jurkat, рекомбинантного IL 2 и синтетическим пептидом,соответствующим последова- ..тельности аминокислот 59-72 интерлей- кина 2 человека.

Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 25 пассажей в культуре,

Криоконсервирование,

Среда для замораживания - 90% ЭТС, 10% ДМСО, Плотность клеток к10 кл/мл. Ампулы с клетками в пенопластовой коробке вьщерживают при минус - 70°С в течение суток и переносят в дюары с жидким азотом. Режим

о

отогрева - водяная баня при 37 С,

0

5

0

5

Контаминация, Контаминации отсутствуют.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1, Йммуноферментный . анализ моноклональных антител ЛНКБ-2.

Образцы, содержащие антитела (су- пернатанты клеточных культур или ас- цитная жидкость), тестируют методом .твердофазного иммуноферментного анализа по связыванию с препаратами IL 2 из клеточной линии Jurkat (удельная активность 8, ед,/мг белка), рекомбинантного IL 2, пептидом, соответствукщим последовательности аминокислот 59-72 IL 2 человека, В л унки 96-луночной планки вносят препарат IL 2 (50 нг на лунку) или пептид (500 нг/лунку) в 0,05 М -бикарбонатном буфере рН 9,6 и остав- -пяют на 18 ч при 4 С, Плашку отмыва1472499

ют 0,1%-ным раствором твина-20 в 0,01 М натрийфосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl (ФСБТ), рН 7,2, и инкубируют с 200 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА.) в течение 1 ч при З7 с. Плашку снова отмывают ФСБТ и вносят в лунку по 100 мкл препарата, содержащего антитела. После инкубации в течение ig одного часа при 37°С плашки отмывают ФСБТ и обрабатывают раствором антител к иммуноглобулинам мыши, конъюги- рованных с пероксидазой хрена

ствии додецилсульфата натрия. Выход 70 мг на 1 л культуральной жидкости. При получении иммуноглобулинов из асцитной жидкости гибридные клетки прививают и выращивают в перитоне- альной полости мьшей линии BALB/c. За 7 дней до инъекции клеток мышам вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Асцитную жидкость забирают через 14 дней после введения 4 к клеток на мышь.С одной мыши получают 6 мл асцитной жидкости. После отделения клеток центрифугированием

(100 на лунку, разведение 1:1000, 15 (400 xg) асцитную жидкость разбавля- 1 ч ). Плашку еще раз отмывают ют до концентрации белка 10 мг/мл и

и вносят 100 мкл раствора орто -фени-проводят высаливание 40%-ным сульфатом аммония (2,4 г сульфата аммония на 10 мл разбавленного асцита). Осалендиамина (1 мг/мл) в 1%-ном цитрат- ном буфере (рН 4,5), содержащем

0,05% Н20. Реакцию останавливают через 15 мин добавлением 100 мкл на лунку раствора 2М серной кислоты. Отрицательным контролем служат лунки плашки, не содержащие IL 2, а также

20 ДОК отделяют центрифугированием (10000 xg, 30 мин)5 растворяют в ФСБ, рН 8,2 и диализуют против этого же буфера. Дальнейшую очистку проводят

. - - -. - ---на протеин А-сефарозе по описанной

лунки,.в которые вместо антител кIL 2 25 схеме. Выход гомогенного цо данный вносят нормальный иммуноглобулин мыши. электрофореза в полиакриламидном геПример 2. Получение и очистка ле иммуноглобулина составляет 5 мг моноклональных антител.из 1 мл асцитной жидкости.

Получение и очистка ЛНКБ-2 анти-Определение концентрации ЛНКБ-2

тел из культуральной и асцитной жид- зо антител в культуральной и асцитной

жидкостях.

в лунки 96-луночной плашки вносят по 250 нг кроличьих антител к Ig G мыщи в 0,05 М бикарбонатном буфере, 2g рН 9,6 и инкубируют 18 ч при 4°С. Лунки плашки, отмывают ФСБТ и инкубируют с 200 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (I ч, 37 С). .После отмывки лунок ФСБТ 40 по плашке раститровывают образцы

(100 мкл), содержащие моноклональные антитела, и инкубируют в течение 1 ч при 37 С, затем лунки плашки отмыва- ,- -- -----..- К)т ФСБТ и вносят 100 мкл кроличьих

4В:-культуральную жидкость (200 мл), 5 антител к Ig G мыши, меченных пер- РН которой доводят до 8,2, наносят оксидазой хрена. Далее ИФА проводят на колонку объемом 5 мл. Колонку про- как описано в примере 1. в качестве

кости.

Гибридные клетки наращивают в пластиковых матрасах в среде, RPMI 1640, содержащей 10% ЗТС, 300 мг/л L-глутамина и 51(10- М меркаптоэтано- ла.При посевной плотности 5х 10 кл/мл через пять дней плотность достигает l.xio кл/мл. Культуральную жидкость с максимальной продукцией иммуноглобулинов (75 мкг/мл) получают от клеток в стационарной фазе роста (седьмой день). Очистку иммуноглобу- линов проводят на протеин А-сефарозе

мывают 0,01 М натрийфосфатным буфе-с ром, содержащем 0,15 М хлористого натрия (ФСБ), рН 8,2, и элюируют специфически адсорбировавшийся иммуноглобулин 0,1 М цитратом натрия с 0,15 М NaCl, рН 3,5. Элюат сразу нейтразируют 1М раствором трис-НС1, рН 8,1. Раствор иммуноглобулинов концентрируют до 3 мг/мл и диализуют против ФСБ, рН 7,2. Иммуноглобулин гомогенен по данным электрофореза в 10% полиакриламидном геле в присутстандарта используют нормальные мышиные иммуноглобулины. Концентрация моноклональных антител в культуральной жидкости составляет 75 мкг/мл. Концентрация иммуноглобулина в асцитной жидкости составляет 8 мг/мл.

Определение константы связывания МЛ ЛНКБ-2 с IL 2 и с пептидом, соответствующим последовательности аминокислот 59-72 IL 2 человека.

Константу связывания определяют с помощью ИФА по уравнению К

1472499

ствии додецилсульфата натрия. Выход 70 мг на 1 л культуральной жидкости. При получении иммуноглобулинов из асцитной жидкости гибридные клетки прививают и выращивают в перитоне- альной полости мьшей линии BALB/c. За 7 дней до инъекции клеток мышам вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Асцитную жидкость забирают через 14 дней после введения 4 к клеток на мышь.С одной мыши получают 6 мл асцитной жидкости. После отделения клеток центрифугированием

(400 xg) асцитную жидкость разбавля- ют до концентрации белка 10 мг/мл и

стандарта используют нормальные мышиные иммуноглобулины. Концентрация моноклональных антител в культуральной жидкости составляет 75 мкг/мл. Концентрация иммуноглобулина в асцитной жидкости составляет 8 мг/мл.

Определение константы связывания МЛ ЛНКБ-2 с IL 2 и с пептидом, соответствующим последовательности аминокислот 59-72 IL 2 человека.

Константу связывания определяют с помощью ИФА по уравнению К

1/(4 МАВ -2М,А.В), где МАВ - концентрация антител, соответствующая 50% связыванию от максимального, МАВ - концентрация антител, соответствукяцая 5.0% связыванию от максимального в случае нанесения на плашку вдвое меньшего количества антигена На лунку плашкн наносят cooTBeTctseHHO 100 и 50 нг IL 2 или 500 и 250 нг пептида 59-72, ИФА проводят как в примере 1. Константа связывания антител с IL 2 составляет , а с петидом М ,

Пример 3, Взаимодействие моноклональных антител ЛИКБ-2 с пептидом, соответствующим последова тельности аминокислот 59-72 2 человека,

Пептид Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys- -Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu, соответствующий последовательности 59 -72 интерлейкина 2 человека, получен классическими методами пептидного синтеза в растворе. Гомогенность конечного продукта доказана аминокислотным анализом, тонкослойной хроматографией, н-ЯМР спектрами,

Взаимодействие ЛНКБ-2 антител с пептидом 59-72 проверяется в твердо-, фазном конкурентном иммуноферментном анализе. На плашЛу наносят IL 2 (100 г/лунку).в 0,05 М бикарбонатном буфере с рН 9,6 в течение 18 ч при 4°С. После промывки и пассивирования плакки (пример 1) в лунки вносят 100 мкл раствора антител (5 мкг/мл) в ФСБ с 1%-ным БСА и пептидом в две- ичных разведе.ниях, т.е. проводят конкуренцию антигена, иммобилизован- ного на плашке, с пептидом в растворе за связывание с антителами ЛНКБ- 2). ИФА далее проводят, как в примере 1. Пятидесятипроцентное ингибиро- вание связывания антител с IL 2 наблюдается при концентрации пептида 0,5-мкг/мл.

Таким образом, ЛНКБ-2 антитела специфически узнают последовательность аминокислот 59-72 IL 2 человет ка.

Пример 4, Использование мо-ч. ноклональных антител ЛНКБ-2 для опре,п деления IL 2.

Культуральный супернатант (1,5 л), полученный в результате-ст имуляции

10

15

20

25

30

35

40

5

0

5

клеток линии Jurkat (2vlO кл/мл) конканавалином А (20 мкг/мл) и 4/з- -форбол-12р-миристат- 3W-ацетатом (10 нг/мл), концентрируют ультрафильтрацией до объема 150 мл и высаливают сульфатом аммония (84 г). Осадок растворяют в 5 мл 0,01 М фосфатного буфера, содержащего 0,15 М хло- ристого натрия и 0,1% полиэтиленгли- коля 6000, рН 7-,2 (ФСБП), и наносят на колонку (2, см) с ультрагелем АсА 54. Активные фракции объединяют, наносят на колонку с голубой сефаро-- ЗОЙ CL - 6В (10 мл) и колонку промывают ФСБ. Сорбировавшиеся белки ,элюируют градиентом хлористого натрия ;от 0,15 до 1 М.

После проведения гельфильтрации и деления на голубой сефарозе каждую фракцию тестируют в биологическом тесте (в разведении 1:10) и в твердофазном иммуноферментном анализе (100 мкл из каждой фракции вносят в плащку, далее пример 1). Биологическую активность IL 2 определяют с помощью IL 2 - зависимой линии цито- токсических Т-лимфоцитов ыши. Уровень пролиферации оценивают путем окрашивания клеток 3-(4,5-диметил- тиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий- бромидом. Количественную оценку ocyw -. ществляют сравнением тестируемых образцов IL 2 с международным стан- дартом (BRMP Reference reagent, 13, ЫО ед../мг),

Иммуноферментное и биологическое тестирования дают одинаковые профили элюирования IL 2,

Таким образом, использование штамма гидридных клеток ЛНКБ-2 позволяет получить моноклональные антитела к IL 2 человека; штамм-продуцент явля-. ется более продуктивным (на 33%), чем известные; продуцируемые этим штаммом МА отличаются от известных более высокой константой связывания и дпя них установлен участок связывания на молекуле-IL 2.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируе « 1х клеток животных Mus musculus BCKK(II) № 128Д, используемый для получения моноклональных антител к интерлей- кину-2 человека.

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Цель изобретения - создание нового более доступного штамма гибридных клеток - продуцента моноклональных антител (МА) к интерлейкину-2 человека, обеспечивающего более высокий уровень биосинтеза МА с высокой константой связывания. Штамм гибридных клеток ЛНКБ-2 получен от слияния миеломных клеток X63 AG 8 653 со спленоцитами мыши, иммунизированной препаратом рекомбинантного интерлейкина-2. Слияние проводят полиэтиленгликолем 4000, содержащим 10 об.% диметилсульфоксида. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 128Д. Концентрация МА в культуральной жидкости 75 мкг/мл, в асците 8 мг/мл. Константа связывания антител с 1L2 составляет 3^.10⁸ М^-1. МА, продуцируемые штаммом, связываются как с гликозилированным, так и рекомбинатным интерлейкином-2, а также пептидом, соответствующим последовательности аминокислот интерлейкина-2 человека 59-72. Получаемые МА являются иммуноглобулинами класса G2B. МА используют для определения интерлейкина-2 в биологических жидкостях и бактериальных лизатах.