Способ выделения тироксинсвязывающего глобулина Советский патент 1986 года по МПК C07K1/16 

W

с

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ТИРОКСИН,СВЯЗЬВАЮЩЕГО ГЛОБУЛИНА из сыворотки Кл- ч-v 13 13 Ttrv.- .-.л 5й5сй 1« р :. крови путем хроматографии, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода- белка, хроматографию осуществляют на сорбенте,представляющем собой матрицу, ковалентно связанную с тироксином, с последую- . щей промывкой сорбента бикарбонатным буфером, затем раствором холата натрия, элюцией белков раствором щелочи при рН 9,3-12 и очисткой элюата на гидроксиапатите в натрий-фосфатном буфере.

to

00 СП Од Ф 1 , . Изобретение относится к области биохимии и медицины, в частности к вьщелению тироксиневязьшакщего глобулина (тег), который может быть использован в качестве компонента диагностических наборов для определения тег в крови человека. Известен способ выделения белковой смеси, связьгоающий тироксин, :заключающийся в инкубации сыворотки или плазмы крови человека с тирркси ном, ковалентно связанным с сефароЗОЙ, отмывке тироксин-сефарозы бикарбонатным буфером и элюции целевого продукта раствором щелочи. Целевым продуктом является белковая смесь, содержащая кроме ТСГ и други тироксинсвязьгоающие белки (альбумин и преальбумин), с выходом до 90% по ТСГ. Наиболее близким техническим .решением является способ вьщеления ТСГ, заключающийся в аффинной хроматографии плазмы крови человека на трииодтиронинсефарозе. После отмывк матрицы от неспецифически связанных белков 0,1 М барбиталовым буфером (рН 8,6), содержащим 1 М NaCiBO,1 трис-НС t буфере (рН В,.6), содержащи 2 М NaCt в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 6,8) и содержащим 2 М NaCt в 0,1 М трис-НСt буфере (рН 8,6), злюцию целевого продукта осуй ествляют раствором тироксина (100 мг/л) в 0,1 М трис-HCt буфере (рН 8,6).. Дальнейшую очистку полученного аффинного алюата от альбумина осуществляют на конканавалин-А-сефароз в 0,05 М трис-HCt буфере (рН 7,4). ТСГ элюируется 0,03 М раствором Х--метил-В-маннозида в 0,05 М трисНС t буфере (рН 7,4). Общий выход ТСГ составляет 60%. . Основными недостатками способов являются не высокий выход целевого продукта и получение его в комштексе с природным лигандом - тироксино что может затруднить его дальнейшее использование.. Целью изобретения является повышение выхода белка. Поставленная цель достигается тем, что в способе вьщеления тирокс связывающего глобулина из сьгаоротки крови путем хроматографии, хроматографию осуществляют на сорбенте, представляющем собой матрицу, кона69лентно связанную с тироксином, с последунщей промывкой сорбента бикарбонатным буфером, затем раствором холата натрия, элюцией белков раствором щелочи при рН 9,3-12 и очисткой элюата на гидроксиапатите в натрий-фосфатном буфере. 1 л ретроплацентарной сыворотки перемешивают в течение 6 ч при со 100 мл аффинного сорбента, содержащего 1 мкмоль коньюгированного тироксина на 1 мл сефарозного геля, что создает концентрацию тироксина . Аффинный сорбент отделяют путем фильтрования суспензии на пористом фильтре и промЬшают 1,5 л О,1 М NaHCOa (рН 8,6). Гель переносят на колонку с пористым стеклянным фильтром и отмывают 100 мл 12 мМ раствора холата натрия, а затем 0,1М раствором NaHCOj (рН 8,6) до получения элюата с постоянной плотностью на 280 нм. Элюцию целевого продукта осуществляют при комнатной температуре 0,001 М NaOH (рН 10,8). Выход ТСГ составляет 36 мг или 90%. Хроматография на гидроксиаппатите. Полученные из ретроплацентарной сыворотки 45 мг аффинного элюата, содержащего 80% ТСГ в 20 мл щелочного раствора, диализуют против 0,005 М, натрий-фосфатного буфера (рН 7,0) и разделяют на две порции по 10 мл. Одну порцию аффинного элюата наносят на колонку с 15 мл гидроксиаппатита, уравновешенную 0,005 М натрий-фосфатным буфером (рН 7,0). Го|могенный ТСГ элюируется в стартовом буфере. Гидроксиаппатит регенерируют промывкой О,1 М натрий-фосфатным буфером, а затем 0,005 М натрий-фосфатным буфером (рН 7,0) и наносят вторую порцию. Количество вьщеленного ТСГ составляет 30 мг или 84%. Общий выход от содержания ТСГ в стартовой сьюоротке составляет 75%. Полученный данным способом препарат ТСГ содержал одну белковую полосу при электрофорезе в 5 и 7,5%-ном полкакриламидном геле (ПААГ) при рН 7,0, 8,3, 9,5. . Электрофорез в ПААГе в присутствии додецил сульфатанатрия (SDS) также дал одну белковую полосу. При гель-фильтрации препарата на сефадексе G-100 был получен один симматричный пик.

311285694

Молекулярная масса, полученная Полученные физико-хивдетеские хас помощью гель-фильтрации и SDS-рактеристики позволили судить о гофореза, составляла 54000-55000 Д.могенности препарата, полученного

Константы ассоциации тег с тиро- да«ным способом.

ксином и трииодтиронином при Способ гарантирует двухстадийное

имеют величины 2,5 i- Ю и 2,0-юм,.выделение гомогенного ТСГ с высоким

соответственно. Аминокислотный и мо-выходом и хорошей воспроизводимостью,

носахаридный составы хорошо корре-при этом выход белка повышается с

лируют с данными других авторов.60 до 80-85%. „