Способ иммобилизации алкогольоксидазы Советский патент 1990 года по МПК C12N11/08 G01N27/40 

Изобретение относится к способам иммобилизации ферментов, а именно к технологии получения иммобилизованной алкогольоксидазы, которая ис- пользуется в анализаторах для определения этилового спирта в крови и других биологических растворах.

Цепь изобретения - повьшение активности и стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы.

Способ заключается в том, что при иммобилизации алкогольоксидазы из Candida boidinii путем включения фермента в гелевую структуру, содержащую сывороточньй альбумин и глу- таровый альдегид в буферном растворе, и последующего нанесения его на лавсановую мембрану - ядерный фильтр, в гелевую структуру дополнительно

вводят азид натрия в концентрации 0.25-500 ммоль, а иммобилизацию про-. водят при рН 8,0-9,0.

Азид натрия комплексируется в активном центре алкогольоксидазы. Это подтверядает изменение в спектре поглощения алкогольоксицазы в присутствии азида натрия в области 400- 700 нм. |

На чертеже показаны спектры поглощения алкогольоксидазы в отсутствие (кривая А) и в присутствие (кривая Б) азида натрия.

Пример 1. 3,0ед. алкогольоксидазы из Candida bo.idiniij 8 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в 0,1 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,1 М

сл KCl,- 1 мМ ЭДТА и 50 ммоль азида нат- .рмя. В раствор добавляют 0,02 мл 5%- ного глутарового альдегида, смесь тщательно перемешивают и выливают на макропористую лавсановую мембрану (цериый фильтр) проницаемостью 10,7 диаметром, пор 0,54 мкм, площадью 9:см. Для получения ферментной мем- , применяемой в анализаторах дл о)1ределения этилового спирта, на по-п в рхность приготовленной двухслойно мфмбраны надевают ацетатцеплюлозную мфмбрану толщиной 10 мкм. Полученную трехслойную мембрану помещают в хо- лфдильник в течение суток, затем раз на куски, надевают на элект- рфд и, тщательно отмыв струей буфера огаределяют ток ферментного электрода пи рН 8,0 при 0,6 В отн. Ag/AgCl

э/ ектрода сравнения.

I Аналогично проводят иммобилизацию а когольоксидазы с использованием ази д4 натрия в концентрациях 100 и 5(|)0 ммоль или в отсутствии азида натрйя по известному способу. Готовят а1| алогичные примеру 1 ферментные элек тДоды.

, В табл. 1 приведены сравнительные п4раметры полученных электродов. Изме ряния-проводят в 0,01 М фосфатном .буфере (0,1 И КС1, 1 мМ ЭДТА),рН8,0. Из приведенных в табл. i данных врдно, что при тех же концентрациях эт|анола ток или чувствительность элек

тг) ме

Лс

одов, содержащих иммобилизованные ;мбраны, изготовленные согласно пред .гаемому способу (2-4), значительно вь|1ше, чем содержащих мембрану, приготс|вленную согласно известному спо- сс|бу.

Мембраны, изготовленные согласно иг вестному способу, обладают низкой ч вcтвитeльнocтью и непригодны для использования в анализаторах этанола, поскольку при определении в реальных многокомпонентных средах соотношение фонового и полезного сигнал:ов превышает 5% из-за наличия в них посторон- HJ-tx веществ. .

Пример 2, Для выяснения ин- тервалов используемых конц€:нтраций а(ида натрия аналогично примеру 1 проводят иммобилизацию алкогольоксидазы без нанесения ферментного раствора на ядерный фильтр с использованием а:-1ида натрия в гелевой структуре в различных концентрациях. В этих иммобилизованных препаратах при

-0,6 В отн. Ag/AgCl электрода сравнения определяют алкогольоксидазную активность в Е/г. Вычисляют остаточную ферментативную активность (%) по сравнению с неиммобилизованным препаратом. Измерения проводят в 0,01 М фосфатном буфере, .рН 8,0 (1,0 М КС1, 1 мМ ЭДТА) в присут ствии 10 NM этилового спирта.

Полученные данные приведены в табл.2.

Данные, приведенные в табл.2, показывают, что при концентрациях азид натрия 0,25-500 ммоль активность иммбилизованной алкогольоксидазы увеличивается в 1,5-40 раз по сравнению с ферментным препаратом, приготовленным без азида натрия. При концентрации азида натрия более 500 ммоль активность уже не увеличивается. Кроме того, увеличивать концентрацию нецелесообразно, так как гель при больших концентрациях азида натрия становится менее жестким, а следовательно, ухудшаются механические свойства получаемых ферментных мембран. При эксплуатации менее жесткой ферментной мембраны фермент начинает вымываться из геля. Таким образом, оптимальные концентрации азида натрия при изготовлении ферментной алкоголь- оксидазной мембраны 0,25-500 ммоль.

Активность иммобилизованной алкогольоксидазы зависит от рН буферного раствора, в котором проводятся измерения . При наличии в буферном растворе 10 мМ этилового спирта и.используя ферментную мембрану, приготовленную по примеру 1 с азидом натрия в гелевой структуре 100 ммоль, при рН 6,0 ток электрода равен 12 нА, при рН 7,0 - 22 нА, при рН 7,5 - 27 нА, при рН 8,0-32,5 нА, при рН 8,5 - 35 нА, при рН 9,0 - 32,5 нА, при 10 - 20 нА. Таким образом, наилучшие результаты реализации способа получаны в буферных растворах рН 8,0-9,0. Пример 3. Дпя определения стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы изготавливают ферментную мембрану с использованием азида ,натрия концентрации 500 ммоль и по известному способу по примеру 1 и определяют зависимость тока электрода от продолжительности эксплуатации.

Полученные результаты приведены в табл.3 (концентрация этилового

спирта в ячейке 0,5 мМ, другие условия аналогичны примерам 1, 2).

Электроды, содержащие мембраны, работают в среднем по 8 ч сут при комнатных условиях. Остальное время суток ферментные мембраны хранятся в буферном растворе при комнатных условиях.

Из табл.3 видно, что чувствительность электрода, приготовленного на основе иммобилизованной алкогольо сидазы по предлагаемому способу, в течение 1 мес эксплуатации уменьшается на 50%, тогда как мембрана, приготовленная по известному способу.

16.15179

полностью теряет активность в°течение 10 дней.

Формула изобретения

Способ иммобилизации алкогольок- сидазы, включающий введение алкоголь- оксидазы из Candida boidinii в геле- вую структуру, содержащую сывороточный и глутаровый альдегид в буферном растворе, и последующее нанесение на ядерный фильтр, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности, в гелевую структуру дополнительно вводят азид натрия в концентрации 0,25-500 ммоль, а иммобилизацию проводят при рН 8,0-9,0.

Таблица t

Изобретение относится к способам иммобилизации ферментов, а именно к технологии получения иммобилизованной алкогольоксидазы, которая используется в анализаторах для определения этилового спирта в крови и других биологических растворах. Цель изобретения - повышение активности и стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы. Способ заключается в том, что при иммобилизации алкогольоксидазы путем включения в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин и глутаровый альдегид в буферном растворе, и последующего нанесения его на лавсановую мембрану - ядерный фильтр, в гелевую структуру дополнительно вводят азид натрия в концентрации 0,25-500 мМ, а иммобилизацию проводят при PH 8,0-9,0. 1 ил. 3 табл.

Количество лэида на р

.., „„ . -«--ра«ии тило«гГс ;„рта. ;;;г

: ольI I ° 1 у 0

0,213

Известный способ 0.017 0.0330.0«70.0700,107 0.1330,173

Предлаглемьй спосов

JOLJLiJI.J|.J|.

I I О

...1..„1 1 JJ°° J

.. о.обз о.о7о

0.9

«.9

2,1

3,5

0,30

10

0,213

Табляц 2

250

0,30

0. 1.08 1,00 0,93

3,5

10

24

33

31

100 НМ