СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА СТРЕПТОКОККОВ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 A61K39/09 

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии.

Идентификация бета-гемолитического стрептококка основана на определении группоспецифического антигена, экстрагированного из микробной клетки химическим или ферментативным методом.

Известен способ идентификации стрептококков, который заключается в выделении чистой культуры и последующей экстракции группоспецифического антигена с использованием фермента [1].

Недостатком этого метода является его длительность, т.е. на определение серологической группы стрептококка уходит 2-3 сут, при этом необходимо иметь специально оборудованное помещение (бокс), а также обученный персонал, владеющий методами бактериологической работы.

Также известен способ экспресс-диагностики стрептококка группы А ферментативной обработкой с последующей постановкой одной из иммунологических реакций-латекс-агглютинации [2].

Однако такой способ позволяет определять только стрептококк группы А в течение 70 мин.

Наиболее близким к предлагаемому способу экстракции группоспецифического антигена для экстресс-диагностики стрептококковой инфекции является способ экспресс-диагностики острой стрептококковой инфекции [3].

Недостатками этого способа являются определение только стрептококка группы А; длительная экстракция (40 мин) группового полисахарида А (группоспецифического антигена стрептококка группы А, при комнатной температуре; неполное освобождение полисахарида А из клеток стрептококка при экстракции, что влияет на чувствительность способа.

Целью изобретения является сокращение времени экстракции группоспецифического антигена стрептококка группы А, повышение чувствительности экспресс-диагностики стрептококковой инфекции и экстракция группоспецифического антигена из других групп стрептококка (В,С,G,F).

Это достигается тем, что экстракцию группоспецифического антигена проводят литическими ферментами из культуральной жидкости Streptomyces levoris 96 (1) в течение 10 мин при температуре 35-40^оС или 15 мин при температуре 18-25^оС.

Способ осуществляется следующим образом: готовится экстрагируемый реагент, содержащий литические ферменты Streptomyces levoris 96; готовятся контрольные культуры стрептококка; проводят экстракцию группоспецифического антигена с последующей его идентификацией в одной из иммунологических реакций.

Подготовка реагента.

Продуцент S. levoris 96 культивируют в 20-литровом ферментере. В качестве посевного материала используют 48-часовую глубинную культуру S.levoris 96 в количестве 5% от объема питательной среды. Для глубинного культивирования продуцента используют кукурузную среду в количестве 10 л, которую стерилизуют при давлении 1 ати в течение 30 мин. Перед посевом добавляют 0,03 л подсолнечного масла в качестве пеногасителя. Ферментацию ведут в течение 70 ч при температуре 28^оС. Скорость вращения мешалки 250 об/мин, аэрация: 1 объем воздуха/1 объем среды/мин.

Культуральную жидкость освобождают от мицелия сепарированием. Мицелий отбрасывают. Из оставшегося нативного раствора высаливают белки сульфатом аммония, который вносят в нативный раствор постепенно при перемешивании до конечной концентрации 70% и оставляют на 18 ч при температуре 4^оС. Надосадочную жидкость декантируют, оставшийся рыхлый осадок центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин при температуре 4^оС. Полученный плотный осадок растворяют в 1 л 0,002 М калийфосфатного буфера и проводят диализ против этого же буфера. После диализа раствор белков наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенную 0,002 М калийфосфатным буфером рН 8,0. Полученную первую фракцию наносят на колонку с КМ-целлюлозой, предварительно уравновешенную 0,002 М калийфосфатным буфером (рН 8). Белок, элюированный исходным буфером, представляет собой комплекс литических ферментов, в составе которых присутствует литическая эндопептидаза, но отсутствуют эндо-N-ацетилглюкозаминидаза и эндо-N-ацетилмурамидаза. Лиофилизированный раствор ферментов хранится при температуре 4^оС.

Для работы лиофилизированный препарат ферментов растворяют в дистиллированной воде с конечной концентрацией белка 0,1-0,3 мг/мл.

Подготовка контрольных культур.

В качестве контрольных культур используются эталонные штаммы стрептококка серологической группы А коллекции центра ВОЗ по изучению стрептококковых инфекций в г.Праге (ЧСФР) - У17АН-6/49 и музейные штаммы В, С, F, G групп стрептококка из той же коллекции.

Из 18-часовой культуры данного штамма, выращенной на бульоне Todd-Hewitt ("Difco") при 37^оС в течение 18 ч, готовится исходная взвесь - 10⁹ клеток в 1 мл с помощью оптического стандарта мутности на 10 ед. (ГИСК им. Л. А. Тарасевича Минздpава СССР). Данная взвесь используется для получения контрольных концентраций клеток стрептококка 10⁷ и 10⁴. Взвеси клеток других групп стрептококка готовятся аналогично.

Выделение группоспецифического антигена.

В пробирки, содержащие 0,1-0,3 мл физиологического раствора или фосфатного буфера рН 7,6-8,0, вносят взвесь микробных клеток (контрольной культуры) или ватный тампон с культурой, взятой из зева больных или бактерионосителей, и добавляют 0,1 мл ферментного раствора, содержащего 0,1-0,3 мг/мл белка.

Постановка реакции латекс-агглютинации осуществляется с коммерческими реактивами, ИФМ - с антисыворотками к группоспецифическому полисахариду группы А фирмы "Wellcome", а также приготовленными в лаборатории.

П р и м е р 1. Мазок из зева обследуемых лиц забирается с помощью стерильных ватных тампонов. Тампоны вносят в пробирки, содержащие 0,2 мл физиологического раствора, которые интенсивно встряхивают в течение 20 с на "Vortex". Затем добавляют 0,1 мл раствора фермента, выделенного из культуральной жидкости Streptomyces levoris 96. Гидролиз проводят 15 мин при комнатной температуре. Тампон прессуется для освобождения жидкости, которую берут для проведения иммунологической реакции латекс-агглютинации с коммерческими реактивами. Весь анализ занимает 20 мин. В табл.1 приведены полученные данные.

П р и м е р 2. У пациентов из зева берут мазок с помощью стерильных ватных тампонов. Тампоны вносят в пробирки, содержащие 0,3 мл фосфатного буфера (0,01 М, рН 8,0) и 0,1 мл раствора ферментов из S.levoris 96, и помещают в водяную баню или в термостат при температуре 37^оС на 10 мин. В табл. 2 приведены полученные данные.

П р и м е р 3. Использование иммуноферментного метода (ИФМ) для идентификации стрептококка группы А
У пациентов из зева берут мазок с помощью стерильных ватных тампонов. Тампоны вносят в пробирки, содержащие 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл раствора ферментов из S.levoris 96. Гидролиз проводят при 37^оС в течение 10 мин. Реакцию останавливают при 100^оС в течение 2 мин. Тампон прессуется для освобождения жидкости, которая используется для постановки реакции в ИФМ. Выявление антиген-антительного комплекса проводили антикроличьими овечьими антителами, конъюгированными с пероксидазой. Использовали прямое нанесение антигена, а также "сэндвич-систему" в ИФМ.

Для сравнения предлагаемого способа и прототипа по идентификации стрептококка группы А проведен опыт, где пробы готовили следующим образом: микробные клетки стрептококка группы А в количестве 10⁴ вносили в центрифужные пробирки, осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30 мин. Супернатанты осторожно сливали. Остатки жидкости в пробирках удаляли высушиванием фильтровальной бумагой. В одни пробирки к образцам добавляли 0,2 мл физиологического раствора и 0,1 мл раствора ферментов. Гидролиз проводили при 37^оС 10 мин. Лизис останавливали кипячением пробирок в течение 2 мин. Остальные пробирки с образцами обрабатывали по прототипу, где экстракцию группоспецифического полисахарида проводили 15 мин при 37^оС. Объем всех проб доводили до 1 мл и их содержимое исследовали в ИФМ. В табл.3 приведены полученные данные, из которых следует, что способ идентификации стрептококка группы А с использованием комплекса литических ферментов из S. levoris 96 для экстракции группового полисахарида А является более чувствительным (в 2-3 раза) по сравнению с прототипом.

Использование: изобретение относится к медицине и микробиологии и может быть использовано в целях быстрой диагностики стрептококковой инфекции. Сущность изобретения: по предлагаемому способу мазок из зева больных и бактерионосителей берется ватным тампоном, который затем обрабатывается раствором литических ферментов для экстракции группоспецифического антигена с последующей идентификацией его в растворе иммунологическими стандартными реактивами латекс-агглютинации. Экстракция антигена из клеток микроорганизмов осуществляется литическими ферментами из культуральной жидкости Streptomuces levoris 96 и проводится 10 мин при температуре 35 - 40°С или 15 мин при температуре 18 - 25°С. 3 табл.

СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА СТРЕПТОКОККОВ, включающий помещение тампона с мазком клинического материала в пробирку с экстрагирующим реагентом, их тепловую обработку, отжим из тампона экстракта, содержащего антиген, отличающийся тем, что в качестве экстрагирующего реагента используют раствор литических ферментов из культуральной жидкости Streptomyces levoric 96 и обработку проводят в течение 10 мин при 35 - 40^oС или 15 мин при 18 - 25^oС.