Способ получения лизирующих ферментов Советский патент 1978 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ

Фосфорнокислый калий

двузамещенный0,1-0,5

II. Кукурузная мука0,5-5,0

Соевая мука1,0-8,0

Фосфорнокислый калий

двузамещенный0,1-1,0

Хлористый натрий0,1-0,7

Цинк сернокислый0,0001-0,001

Выделение ферментов, лизирующих стрептококк группы А, осуществляют препаративным электрофокуспрованием в градиенте рН от 2 до 10 с последующим освобождением от амфолинов гсльфильтрацией на Сефадексе G-25.

Пример 1. Конические колбы емкостью 750 мл заполняют 100 мл жидкой питательной среды следующего состава, %:

Казеиновый гидролизат0,40

Хлористый натрий0,50

Глюкоза0,30

Калий фосфорнокислый

двузамещенный0,15

Вода водопроводнаяДо 100

рН среды 7,2. Колбы инокулируют водной суспензией спор Actinomyces levoris 692, выращенного в течение 14-ти суток при 28°С на агаризованной питательной среде с кукурузным экстрактом.

После освобождения культуральной жидкости от мицелия центрифугированием (10000 g, 10 мин) ферменты осаждают в течение ночи при сульфатом аммония (70% насыщения). Образовавшийся осадок центрнфугирутю на рефрижераторной центрифуге (10 000 g, 10 мин, ). Г1олученный осадок белков растворяют в 1-2 мл холодного 0,02 М бикарбонатного буфера и проводят обессоливание гельфильтрацией на Сефадексе G-25. Осадок растворяют в 1 мл 0,02 М бикарбонатного буфера и хроматографируют па диэтнламиноэтилцеллюлозе (хроматографическая колонка 2,5X30). Получают активную фракцию, содержащую ферменты, которую лиофильно высущивают и определяют литическую активность. Литическая активпость Actinomyces levoris 692 составляет 85% при экспозицип 1 ч и 91% при экспозиции 4 ч.

Пример 2. Конические колбы емкостью 750 мл заполняют 100 мл жидкой питательной среды следующего состава, %:

Кукурузная мука1,000

Соевая мука2,000

Калий фосфорнокислый

двузамещенный0,200

Натрий хлористый0,500

Цинк сернокислый0,001

Вода водопроводнаяДо 100

Колбы инокулируют 5% по объему двухсуточного вегетативного мицелия Actinomyces ievoris 67, выращенного на кукурузной среде в колбах на круговых качалках при скорости 220-250 об/мин п температуре .

После освобождения культуральной жидкости от мицелия центрифугированием (10 000 g, 10 мин) ферменты осалсдают в течение ночи при 4°С сульфатом аммония при насыщении 70%. Осадок центрифугируют на рефрижераторной центрифуге (10 000 g, 10 мин, 4°С).

Осадок белков растворяют в -2 мл 0,02 М. бикарбонатного буфера. Для окончательной очистки ферментов проводят препаративное электрофокусирование в градиенте рН от 2 до 10. Полученную фракцию, содержащую фермент (рП 9,3), освобождают от амфолинов гельфильтрацией на Сефадексе G-25. Активную фракцию, содержащую ферменты, лиофильно высушивают и определяют литическую активность Actinomyces levoris 67,

которая при экспозиции 1 ч составляет 82%.

Для определения лизирующей.. активности

используют суспензию клеток стрептококка

группы А, тип 29 (штамм Д-23/11, №62/59 -

Пражская коллекция). Реакционная смесь для

определения активности лизирующих ферментов содержит 1,0 мл суспендированных клеток стрептококка в 0,075 М (рН 7,6) фосфатном буфере и 2 мл раствора фермента в том же буфере (100-150 мкг).

Об активности ферментов судят по изменению оптической плотности реакциопной среды при 650 нм (температура 37°С, экспозиция 1 и 4 ч), которую выражают в процентах. Исходную оптическую плотность реакционной смеси

(0,5-0,7 о. е.) принимают за нулевую точку. В таблице приведены данные по лизирующей активности ферментов, выделенных из культур актиномицетов. Все указанные в таблице культуры депонированы в коллекции

культур ВНИИА под соответствующими регистрационными номерами.

Полученные ферменты обладают высокой активностью, специфичностью и стабильностью. Они использованы для выделения и изу65 чения нативных антигенов стрептококка группы А. Антигены, полученные при помощи этих ферментов в соответствии с настоящим изобретением, имеют следующие преимущества: сохраняют нативную структуру и обладают специфическими иммуногенными свойствами; дают возможность получать специфические антисыворотки; открывают перспективу создания антистрептококковой вакцины.

Формула изобретения

Способ получения лизирующих ферментов путем культивирования микроорганизмов рода Actinomyces на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, и последующего выделения ферментов, отличающийся тем, что, с целью получения ферментов, лизирующих стрептококк группы А без разрушения стрептококковых антигенов, из микроорганизмов рода Actinomyces используют:

Actinomyces levoris692

Actinomyces levoris67

Actinomyces levoris64

Actinomyces levoris95

Actinomyces levoris109

Actinomyces griseolus88

Actinomyces alboflavus194

Actinomyces griseochromogenes275

Actinomyces odorifer406

Actinomyces streptomycini83

Actinomyces citreus187

Actinomyces albus454

Actinomyces species492

Actinomyces species161

Источники информации, принятые :во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР №528340, кл. С 13К 1/00, 1975.