СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 1,3- β -ГЛЮКАНОВ Российский патент 1994 года по МПК C12N9/24 

Изобретение относится к биохимии, а именно, к способу определения полисахаридов - 1,3- β -глюканов, и может найти применение в микробиологической, пищевой промышленности. Особенно большой интерес способ представляет для определения содержания ламинарана в водорослях при их переработке и хранении.

Известен способ определения содержания 1,3- β -глюкана, в частности ламинарана в водорослях путем экстракции, осаждения, сушки и взвешивания. Этот способ является длительным и трудоемким. Кроме того, из-за многостадийности способа наблюдаются потери ламинарана, что снижает точность определения.

В качестве пpототипа выбран способ количественного определения 1,3- β -глюканов, в частности ламинарана в водорослях, предусматривающий экстракцию 0,4% -ным раствором соляной кислоты, осаждение, ферментативный гидролиз содержащегося в осадке полисахарида с последующим определением количества образующейся глюкозы. При этом используют фермент моллюска, по механизму действия являющийся эндо-1,3- β -глюканазой.

Недостатками известного способа являются его многостадийность и невысокая точность определения, связанная, во-первых, с недостаточно полной экстракцией полисахарида раствором соляной кислоты, и, во-вторых, с особой специфичностью действия эндо-1,3- β -глюканазы, которая имеет тот недостаток, что гидролизует полисахарид не полностью до глюкозы, а с образованием, также и коротких олигосахаридных цепей.

Цель изобретения - повышение точности определения и упрощение анализа. Цель достигается применением ферментной системы экзо-1,3- β -глюканаз гриба Geotrichum candidum ЦМПМ F-220. Ферментный препарат выпускает НПО "Биолар" (г. Олайне) под названием "Целлокандин" или "Целломикс". Штамм защищен с. N 1125247. Указанный гриб синтезирует три формы ферментов, расщепляющих 1,3- β -глюканы по концевому механизму действия посредством отщепления ангидроглюкозных остатков с нередуцирующего конца молекулярных цепей полисахарида. Единственным продуктом реакции при действии ферментного препарата гриба Geotrichum candidum ЦМПМ F-220 является глюкоза- по количеству которой судят о количестве 1,3- β -глюканов. Большое преимущество предлагаемого способа заключается в том, что определение ламинарана в водорослях можно осуществлять без предварительной экстракции и осаждения полисахарида.

П р и м е р 1. Определение содержания ламинарана в водорослях.

Сухие водоросли измельчают в ступке до порошкообразного состояния. В пробирку вносят 100 мг измельченных водорослей, добавляют 2 мл раствора целлокандина в 0,1 М ацетатном буфере pH 4,5 с активностью 1,3- β -глюканазы 10 МЕ/мл (1 МЕ - 1 μМ глюкозы/мин). Для контроля за содержанием сахаров в субстрате в другую пробирку вносят 100 мг измельченных водорослей и 2 мл ацетатного буфера без ферментного препарата. Для контроля за содержанием сахаров в ферментном препарате в третью пробирку вносят 2 мл раствора целлокандина в ацетатном буфере. Содержимое пробирок перемешивают, пробирку закрывают ватными пробками и помещают для ферментативного гидролиза в термостат с температурой 40^о и перемешиванием. Через 24 ч из пробирок, не взмучивая осадок, отбирают пробу для определения содержания глюкозы. Глюкозу определяют методом Шомодьи-Нельсона. Содержание глюкозы в исследуемой реакционной смеси определяют по формуле
Г=[E₁-(E₂+E₃)] ˙ K ˙ n ˙ V,
где Е₁ - оптическая плотность раствора пробы;
Е₂ - оптическая плотность раствора "контроль субстрата";
Е₃ - оптическая плотность раствора "контроль ферментного препарата";
К - коэффициент пересчета содержания глюкозы по данным калибровочного графика;
n - принятое разведение пробы;
V - объем реакционной смеси в мл.

При определении содержания ламинарана в бурой водоросли Laminaria saccharina (Белое море) Е₁, Е₂ и Е₃ равны 0,310, 0,01, 0,02 соответственно, К= 0,6, n=100, V=2. Таким образом, количество глюкозы в 2 мл реакционной смеси составляет 32,4 мг. Расчет содержания ламинарана (в %) от веса сухой водоросли ведут по формуле
Л = ,
где Г - количество глюкозы в мг, которое было найдено в 2 мл ферментативного гидролизата водоросли;
0,9 - коэффициент пересчета количества глюкозы в соответствующее количество ламинарана, состоящего из ангидроглюкозных остатков, имеющих молекулярную массу 162, а не 180, как глюкоза;
В - сухая навеска водоросли в мг.

Содержание ламинарана в водорослях было найдено равным 29,16%.

П р и м е р 2. Определение 1,3- β -глюкана из дрожжей.

Используют препарат дрожжевого глюкана, выделенный из клеточных стенок дрожжей.

К 2 мл 0,1 М ацетатного буфера pH 4,5 добавляют 2 мг препарата дрожжевого глюкана и 1 мл раствора целломикса в том же буфере с активностью 3 МЕ/мл.

Для контроля за содержанием сахаров в субстрате в другую пробирку вносят 3 мл ацетатного буфера pH 4,5, 0,1 М и 2 мг препарата дрожжевого глюкана. Для контроля за содержанием сахаров в ферментном препарате в третью пробирку к 2 мл ацетатного буфера добавляют 1 мл раствора целломикса в том же буфере. Во все реакционные смеси добавляют антисептик азид Na или мертиолат в количестве 1-2 мг. Содержимое пробирок перемешивают, закрывают резиновыми пробками и помещают для ферментативного гидролиза в термостат с температурой 40^о. Через 72 ч из пробирок отбирают пробы для определения содержания глюкозы методом Шомодьи-Нельсона. Содержание глюкозы в исследуемой реакционной смеси рассчитывают так же, как в примере 1.

В данном случае при определении содержания дрожжевого глюкана в препарате из клеточных стенок дрожжей Е₁, Е₂ и Е₃ равны 0,501, 0,063, 0,0 соответственно, К=0,6; n=2,5; V=3. Таким образом, количество глюкозы в 3 мл реакционной смеси составляет 1,97 мг.

Расчет содержания дрожжевого глюкана от веса исследуемого препарата проводят как в примере 1. Содержание глюкана в исследуемом препарате дрожжевого глюкана составляет 88,65%.

Таким образом, описанный способ позволяет упростить процесс определения 1,3- β -глюканов, при этом также увеличивается точность анализа.

Использование: в области биохимии, микробиологическая и пищевая промышленность. Сущность изобретения: исследуемый образец измельчают, добавляют ферментный препарат экзо - 1,3 - b - глюканазы гриба Geotrichum candidum ЦМПМ F-220 в количестве 0,1 - 1,5 МЕ 1,3 - b-глюканазной активности на 1 мг образца. Гидролиз проводят в течение 24 - 72 ч при 40 °С. Определяют количество образующейся глюкозы.

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 1,3- β -ГЛЮКАНОВ, предусматривающий ферментативный гидролиз исследуемого образца с последующим определением количества образовавшейся глюкозы, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения точности определения, ферментативный гидролиз проводят при 40^oС в течение 24 - 72 ч с помощью ферментативного препарата экзо- 1,3- β - -глюканазы гриба Geotrichum candidum ЦМПМ F-220, при этом препарат вводят в количестве 0,1 - 1,5 МЕ 1,3- β - -глюканазной активности на 1 мг образца.