СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1 -> 3, 1 -> 6-БЕТА-D-ГЛЮКАНА, ОБЛАДАЮЩЕГО ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК C12P19/04 C12P19/16 A61K35/80 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, касается способов получения активных препаратов углеводной природы из сырья растительного происхождения, в частности, бурых водорослей.

Смешанные 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюканы среди нейтральных полисахаридов представляют наибольший интерес, так как обладают ярко выраженным действием на организмы животных и растений в гораздо меньших концентрациях, чем другие полисахариды [1 3] Некоторые 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюканы являются иммуностимуляторами, обладают радиопротекторными и антиопухолевыми свойствами [1, 2, 4 6]
В качестве прототипа выбран известный способ получения обладающего иммуностимулирующей активностью 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюкана из гриба Pseudoplectanias класс Diseomycetes [7] который заключается в следующем. Мицеллий гриба экстрагируют большими объемами воды, экстракт концентрируют и осаждают вещество равным объемом этанола. 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - Глюкан последовательно очищают диализом, хроматографией на ДЭАЭ- Г-50 сефадексах, снова диализуют и высушивают. Выход вещества составляет 6,5% Глюкан, выделенный из этого гриба, имеет высокий молекулярный вес (около 2,5•10^-5). Соотношение 1 __→ 3; и 1 __→ 6 связанных остатков в молекулах, биологическая активность и действующие дозы 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюкана из гриба Pseudoplectanias класс Diseomycetes близки соответствующим характеристикам получаемого новым способом глюкана транслама.

Как было показано [8, 9] в результате ферментативной трансформации низкомолекулярного 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюкана ламинарина из бурой водоросли Laminaria cichorioides был получен более высокомолекулярный и имеющий другую структуру, чем исходный ламинарин, 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюкан, названный трансламом. Транслам обладает широким спектром биологических активностей: иммуностимулирующим действием, стимулируя Т-систему иммунитета животных [8] проявляет антиопухлевое действие против саркомы-180 [9] Транслам хорошо растворим в воде, при его введении не отмечается побочных эффектов. Эти обстоятельства побудили нас разработать технологичный способ получения транслама, предлагаемый для патентования.

Задача изобретения разработать простой способ получения транслама, позволяющий производить достаточно больше количества целевого продукта.

Поставленная задача решена тем, что в способе получения транслама 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюкана, обладающего иммуностимулирующей активностью, путем воздействия на ламинарин эндо- 1 __→ 3-β-D - глюканазой Ло из двустворчатого моллюска Chlamys albidus и хроматографической очистки целевого продукта, эндо- 1 __→ 3-β-D - глюканазу Ло из Chlamys albidus используют в концентрации (0,7 1)•10^-2 ед/мл, инкубируют смесь до полной инактивации фермента, а хроматографическую очистку целевого продукта реакции осуществляют на полихроме-1 последовательной элюцией побочных продуктов реакции водой, 2,5%-ным водным этанолом, и 10%-ым водным этанолом, целевой продукт транслам элюируют 15%-ым водным этанолом.

Таким образом, поставленная задача выполняется за счет ферментативного способа получения целевого продукта и использования для разделения продуктов ферментативной реакции полихрома (ПХ-1). Было установлено, что фермент Ло при низкой концентрации теряет свою активность в условиях получения транслама в течении суток. При проведении ферментативной реакции используется такое отрицательное свойство эндо 1 __→ 3-β-D - глюканазы Ло, как лабильность. Было подобрано минимальное количество фермента (0,7 1)•10^-2 ед/мл, под действием которого в течение суток происходит трансформация ламинарина с максимальным выходом целевого продукта, а эндо- 1 __→ 3-β-D - глюканаза Ло за это время полностью инактивируется и реакция останавливается. За счет этого происходит экономия фермента, производство которого требует дорогостоящих реактивов, и сокращение стадий контроля за выходом транслама и остановки реакции на нужной глубине.

Далее продукты ферментативной реакции разделяют на полихроме-1, используя ступенчатый градиент вода, водный этанол. Водой и 2,5%-ным водным этанолом элюируют глюкозу и 1 __→ 3 либо 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюкоолигосахариды, 10%-ным водным этанолом фракцию 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюканов (Мм 3 8 кДа), неактивных в животном иммунитете, 15%-ным водным этанолом транслам.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Раствор ламинарина (3 л; 9 10 мг/мл ламинарина в 0,1 М растворе NaCl и 0,05 М ацетатном буфере; pH 5,0 5,5 оптимальные условия для действия фермента [10]) обрабатывают эндо- 1 __→ 3-β-D - глюканазой Ло из Chlamys albidus в концентрации (0,7 - 1)•10^-2 ед/мл (1 единица активности фермента равна такому его количеству, которое катализирует образование 1 мкМ глюкозы в мин). Смесь инкубируют 23 25 ч при 22 25^oC. В течение этого времени в таких условиях происходит накопление транслама в количестве 20 25% от исходного ламинарина, а фермент полностью инактивируется. Далее смесь разделяют на колонке (7 х 65 см) с полихромом-1, используя элюцию водой и 2,5-, 10-, 15-ными водными растворами этанола (табл. 1). Выход транслама составляет 20 - 25%
Способ получения транслама имеет следующие преимущества перед известным. Выделение транслама из продуктов ферментативной трансформации ламинарина проводят с помощью гидофобного сорбента полихрома-1, отличающегося большой емкостью. В основу получения биологически активного 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюкана положен способ ферментативной трансформации ламинарина. Использование в способе способности эндо- 1 __→ 3-β-D - глюканазы Ло из Chlamys albidus к инактивации с течением времени устраняет возможность гидролиза транслама (вплоть до его исчезновения) вследствие передозировки фермента; отпадает необходимость в таких трудоемких стадиях, как контроль за ходом реакции и инактивация избытка фермента (для чего реакционную смесь нужно было бы, например, быстро прогревать, что затруднительно в случае больших объемов).

Способ иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Ламинарин (30 г) растворяют в 3 л 0,05 М ацетатного буфера pH 5,0, содержащего 0,1 М NaCl. Вносят 120 единиц эндо- 1 __→ 3-β-D - глюканазы Ло и инкубируют смесь при 25^oC в течение суток. Инкубационную смесь (3 л) наносят на колонку (7 х 65 см), в которую загружено 2,5 кг полихрома-1. Элюцию проводят сначала водой и 2,5%-ным водным этанолом каждый раз до отрицательной реакции на сахара (по фенол-сернокислотному методу [II]). При этом полностью вымываются соли, глюкоза, низкомолекулярные глюкоолигосахариды. Затем 10 и 15% -ным водным этанолом элюируют, соответственно, фракцию 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюканов (Мм 3 8 кДа), неактивных в животном иммунитете, и транслам, каждый раз отмывая колонку до отрицательной реакции на сахара. Свободный объем используемой колонки 3 л, т.е. после пропускания 3 л элюента начинают выходить сахара. Поэтому при элюции и сборе каждой фракции первые 3 л элюата можно отбрасывать, остальной объем, который содержит сахар, собирать. Все собранные фракции высушивают лиофильно. В этих условиях образуется 93% глюкозы и низкомолекулярных продуктов, выход транслама составляет 3%
Регенерацию полихрома-1 проводят последовательно 50%-ным этанолом (10 л) и водой (10 л). После такой регенерации колонка готова к новому циклу. Свойства сорбента в процессе использования не изменяются, не изменяются также параметры колонки: однажды проанализировав колонку и установив параметры, можно пользоваться этими показателями.

Пример 2. Способ осуществляется как в примере 1, но к раствору ламинарина добавляют 45 единиц фермента. В этих условиях образуется около 32 глюкозы и низкомолекулярных олигосахаридов, 45% фракции 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюканов (Мм 3 8 кДа), неактивных в животном иммунитете, выход транслама 16%
Пример 3 (табл. 2). Способ осуществляется как в примере 1, но к раствору ламинарина добавляют 30 единиц фермента. В этих условиях образуется около 23% глюкозы и низкомолекулярных олигосахаридов, фракция 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюканов (Мм 3 8 кДа) составляет 49% выход транслама 23%
Пример 4. Способ осуществляется как в примере 1, но к раствору ламинарина добавляют 20 единиц фермента. В этих условиях образуется 19% глюкозы и низкомолекулярных олигосахаридов, фракция 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюканов (Мм 3 8 кДа) составляет 55% выход транслама 20%
Пример 5. Способ осуществляется как в примере 1, но к раствору ламинарина добавляют 15 единиц фермента. В условиях образуется 12% глюкозы и низкомолекулярных олигосахаридов, фракция 1 __→ 3; 1 __→ 6-β-D - глюканов (Мм 3 8 кДа) 77% выход транслама 7

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: способ получения транслама - 1 __→ 3; 1 __→ 6 - β - D - глюкана, обладающего иммуностимулирующей активностью, заключающийся в том, что биологически активный _{1__→3;1__→6-β-D-} глюкан получают ферментативной трансформацией ламинарина с помощью эндо- 1 __→ 3 - β - D - глюказаны Ло из двустворчатого моллюска Chlamys albidus, которую используют в концентрации (0,7 - 1)•10^-2 ед/мл, и инкубируют смесь до полной инактивации фермента, а хроматографическую очистку целевого продукта реакции осуществляют на полихроме-1 последовательной элюцией побочных продуктов реакции водой, 2,5%-ным водным этанолом, и 10%-ным водным этанолом, целевой продукт - транслам элюируют 15%-ым водным этанолом. 2 табл.

Способ получения 1 _→ 3; 1 _→ 6-β-D -глюкана, обладающего иммуностимулирующей активностью, включающий стадию его хроматографической очистки, отличающийся тем, что ламинарин подвергают воздействию эндо-1 _→ 3-β-D-глюканазы Л_о из двухстворчатого моллюска Chlamys albidus, взятой в концентрации (0,7 - 1)•10^- 2 ед./мл, причем реакционную смесь инкубируют до полной инактивации фермента, после чего проводят хроматографию продуктов реакции на полихроме 1, с последовательной элюцией их водой, 2,5% -ным, 10%-ным водным этанолом и элюцией целевого продукта 15%-ным водным этанолом.