Способ иммуноферментного определения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 A61K39/395 C12Q1/70 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа иммуноферментного определения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях.

П р и м е р 1. Для иммобилизации антигена клетки перевиваемой культуры FLK, продуцирующие вирус лейкоза КРС, высеивают в стерильные 96-луночные полистироловые панели в объеме 100 мкл ростовой среды (среда Игла с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы) в концентрации 2,8 10 клеток/на лунку и выращивают до образования монослоя в атмосфере с 5% СОа и 96% влажности при 37°С в течение 48, ч. Затем удаляют культуральную жидкость, отмывают клетки 0,01 М фосфатным буфером

рН 7,2 (ФБ) и высушивают панели в течение 18 ч при 37°С. Подготовленные таким образом панели используют непосредственно или хранят при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.

Для пермеабилизации клеток в лунки вносят по 100 мкл 0,25%-ного глутаральде- гида, выдерживают 10 мин при комнатной температуре и 3 раза отмывают ФБ.

Для блокирования неспецифичегких мест связывания в лунки вносят по 100 мкл блокирующего раствора, состоящего из 3%-но- го раствора человеческого сывороточного альбумина, приготовленного на ФБ, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, после чего раствор удаляют встряхиванием.

С целью проведения реакции антигена с антителом в лунки вносят по 100 мкл исследуемых сывороток, содержащих антитела

ON GO

-К СА)

N

к вирусу лейкоза КРС: исследуемую сыворотку мышей (ИСМ), иммунизированных вирусом лейкоза КРС, а разведении от 1:500 до 1:2000; положительную коммерческую сыворотку кроветкоров (ПКС) в рабочем раз- ведении, содержащую антитела к вирусу лейкоза КРС; исследуемую, сыворотку коров (ИСК) в разведении от 1:10 до 1:640 и культуральную жидкость гибридов (КЖГ), продуцирующих антитела к вирусу лейкоза КРС, в разведении от 1:2 до 1:256. Сыворотки разводят в блокирующем растворе.

ИСМ получают при использовании следующей схемы иммунизации: 80 мкглизиро- ванного вируса с полным адъювантом Фрейнда вводят внутрибрюшинно. Через месяц вводят антиген трехкратно с интервалом одной недели. Бустерное введение - в хвостовую вену, 50 мкг белка.

В качестве отрицательного контроля ис- пользуют сыворотку крови здоровых мышей (ОМС) в разведении 1:100; коммерческую отрицательную сыворотку КРС (ОСК), несодержащую антител к вирусу лейкоза КРС, в разведении 1:64.

Панель с исследуемыми биологическими жидкостями иИкубируют 2 ч при 37°С. Несвязавшиеся антитела удаляют и панель промывают 4 раза, как описано.

Для инкубации с мечеными антителами в лунки вносят по 10 мкл ксгнъюгата кроличьих антител к иммуноглобулинам мыши или к иммуноглобулинам быка с пероксидазой хрена в разведений 1:1000 в блокирующем буфере и инкубируют при 37°С 1 ч, после чего 4 раза промывают ФБ.

Для выделения пероксидазной реакции в лунки вноясят по 100 мкл субстрата 2,2 -азино-ди(1-этИл-бензотиазолин сульфо- нат) (ABTS), инкубируют 45 мин при ком- натной температуре в темноте. Ферментативную реакцию останавливают добавлением по 100 мкл 2%-ной лимонной кислоты. Для установления интенсивности окраски продуктов пероксидазной реакции опреде- ляют их опагическую плотность (ОП) спект- рофотометрически при длине волны 416 нм с дальнейшим вычислением оптической величины (ОВ) по формуле:

OR -г ОП исследуемого образца ОП контрольного образца

Например, при определении антител к вирусу лейкоза КРС в сыворотке мышей, иммунизированный вирусом лейкоза КРС, оптическая плотность (ОП) исследуемого образца равна 0,943, а ОП контрольного образца, т.е. сыворотки крови здоровых

мышей, равна 0,304. Делим 0,943 на 0,304 и получаем ОВ, равную 3,1.

П р и м е р 2. Для получения антигена вирус лейкоза КРС выделяют (по прототипу) из перевиваемой культуры клеток линии FLK, продуцирующих вирус лейкоза КРС. Проводят количественное определение вируса лейкоза КРС в культуральной жидкости по ревертазной активности. Культуральную жидкость затем осветляют при 1000 g в течение 20 мин при 4°С. Надосадочную культуральную среду центрифугируют при 5000-10000 g в течение 20 мин при 4°С и вирусные частицы концентрируют в изопик- нической зоне путем прокачивания со скоростью 3,75 л/ч насосом Beckmann-441 осветленной и охлажденной до 2°С культуральной жидкости через проточный ротор СФ-32 ультрацентрифуги Beckmann-L-5- 75, в которой на 60%-ной подушке сахарозы создают в буфере ТНЭ (0,01 М трис-HCI, рН 7,2; 0,1 М NaCI; 0,001 N32 ЭДТА) линейный градиент сахарозы от 20 до 50% (по массе) при 30000 или 32000 об/мин. После центрифугирования содержимое ротора при 3000 об/мин разделяют на фракции, каждая объемом 20 мл. Количество вируса лейкоза КРС в каждой фракции определяют по его ревертазной активности.

В лунки полистироловой панели вносят по 100 мкл раствора вируса с концентрацией 1 мкг/мл в 0,005 М карбонатно-бикар- бонатном буфере, рН 9,5-9,7. Панель оставляют при 4°С на ночь.

Несорбированный вирус лейкоза КРС удаляют встряхиванием, лунки панели трижды промывают 0,05%-ным раствором твина-20, приготовленным на ФБ, после чего вносят в лунки по 100 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на ФБ (блокирующий раствор), инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Раствор удаляют и в лунки вносят по 100 мкл исследуемых: контрольных сывороток или культуральной жидкости гибридом (разведение как описано в примере 1).

Панель с исследуемыми биологическими жидкостями инкубируют 2 ч при 37°С. Несвязавшиеся антитела удаляют и панели промывают.

Инкубацию с мечеными антителами, с субстратом и определение продуктов перок- сиданой реакции спектрофотометрически проводят как описано в примере 1.

В таблице приведены сравнительные данные оптических величин по определению антител к вирусу лейкоза КРС в разных биологических жидкостях, полученные предлагаемым и известным способами.

Как видно из таблицы, сравнение оптических величин, полученных предлагаемым способом и известным, показывает, что предложенный способ позволяет выявить антитела к вирусу лейкоза КРС в исследуемых биологических растворах не в ущерб точности. При этом оптическая величина (0В), полученная по известному способу, находится в интервале от 2,75 до 3,12, в то время как 0В по предлагаемому способу находится в таком же самом интервале, т.е. от 2,55 до 3,16.

Формула изобретения Способ иммуноферментного определения антител к вирусу лейкоза крупного ро

5

гатого скота, включающий нанесение антигена на твердофазный носитель, инкубацию с исследуемой биологической жидкостью, последующее внесение и инкубацию с мечеными пероксидазой антителами к IgG крупного рогатого скота, внесение субстрата и определение продуктов пероксидазной реакции, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и его ускорения, в качестве антигена используют культуру клеток FLK, которую предварительно выращивают на твердофазном носителе до образования монослоя, высушивают и пермеабилизиру- ют глютаровым альдегидом.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Целью изобретения является упрощение и ускорение способа иммуноферментного определения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях. Для этого используют в качестве антигена культуру клеток FLK, выращенную до образования монослоя на твердофазном носителе, после чего высушивают и пермеабилизируют глю- таровым альдегидом. 1 табл.

Обозначения см. премер 1.