СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 1994 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к производству ферментов, а именно к способу получения гидролитических ферментов из животного сырья, например, протеаз, нуклеаз.

Известные способы получения ферментов из животного сырья с использованием сорбционных методов выделения предусматривают получение отдельных ферментов или нескольких протеаз в комплексе, в основном для препаративных целей.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является промышленный способ получения комплекса четырех гидролитических ферментов (дезоксирибонуклеазы, рибонуклеазы, трипсина, химотрипсина) из поджелудочной железы крупного рогатого скота путем экстракции с последующим отделением от жмыха и дробным высаливанием с последующей очисткой, индивидуальной для каждого фермента.

Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, обладает рядом недостатков:
- экстракцию осуществляют в течение 16-17 ч с повторной экстракцией в течение 1 ч;
- отделение экстракта от остатков жмыха и балластных веществ ведут на тканевых фильтрах в течение 3-5 сут;
- готовые формы ферментов не являются гомогенными, а содержат ряд примесей (фиг.1);
- в процессе производства имеются большие потери целевых продуктов, что приводит к низким выходам готовых препаратов.

Целью предлагаемого изобретения является сокращение времени процесса получения ферментов, увеличение их выхода и улучшение качества.

На фиг.1 показаны гельхроматограммы препаратов, полученных по регламентной технологии:
а) трипсин, б) химотрипсин, в) дезоксирибонуклеаза, г) рибонуклеаза; на фиг.2 - кинетика экстракции белка из поджелудочной железы; на фиг.3 - гельхроматограммы препаратов, полученных с использованием заявляемого способа получения гидролитических ферментов;
а) трипсин, б) химотрипсин, в) дезоксирибонуклеаза, г) рибонуклеаза.

Цель достигается использованием способа получения гидролитических ферментов, который осуществляют следующим образом: предварительно измельченную поджелудочную железу подвергают экстракции раствором серной кислоты в течение 3-5 ч. Увеличение времени экстракции больше 5 ч нецелесообразно, так как может приводить к уменьшению содержания ферментов в экстракте (фиг.2). После отделения железы на шнековой центрифуге экстракт, содержащий жировые примеси и балластные вещества, подвергают сепарированию. Неоседающий, непрозрачный экстракт подают на ионообменную колонну с сорбентом со скоростью 50-150 мл/см² ч. Увеличение и уменьшение скорости сорбции вне указанного интервала существенно не влияет на процесс. После окончания сорбции колонну промывают подкисленной до рН 1,5-3,0 водой в количестве, равном свободному объему колонны. Затем осуществляют десорбцию ферментов с ионита путем подачи сверху вниз элюента со скоростью 25-75 мл/см² ч. В качестве элюента используют раствор сульфата аммония в аммиаке с рН 9,0-10,0. Уменьшение скорости подачи элюента и изменение рН элюента меньше 9,0 приводит к "размыванию" целевого пика, увеличению его объема, что не дает достаточной степени концентрирования. Изменение рН элюента больше 10,0 приводит к десорбции с ионита примесей и, как следствие, к ухудшению качества ферментов. Элюат, содержащий более 10 мг/мл белка, определенного по методу Лоури, используют для получения ферментов по действующей технологии со стадии дробного высаливания отдельных ферментов.

Отличительными признаками предложенного способа от прототипа является сепарирование экстракта и сорбция его на ионите с последующей элюцией ферментов, причем в качестве элюента используют раствор сернокислого аммония в аммаке.

Положительный эффект от предложенного технического решения состоит в следующем:
сокращается время технологического цикла получения ферментов в 5 раз; сокращаются потери целевых продуктов и увеличивается съем ферментов с единицы сырья в среднем на 30%; улучшается качество готовых препаратов и условия труда (см. табл. и фиг.3).

П р и м е р 1. 100 кг замороженной поджелудочной железы измельчают до величины частиц около 2 мм и подвергают экстракции 200 л 0,25 н. серной кислоты при 5^oC в течение 3 ч при периодическом перемешивании. После окончания экстракции железу отделяют на шнековой центрифуге, а экстракт сепарируют при 5^oC, после чего подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н⁺-форме в количестве 20 кг. Скорость сорбции 90 мл/см²ч. Объем пропущенного экстракта 105 л, рН 2,0. Затем сорбент промывают 15 л подкисленной водой с рН 2,0 и проводят десорбцию ферментов 1 н. раствором сульфата аммония в 0,1 н. растворе аммиака, подавая элюент сверху вниз со скоростью 45 мл/см² ч при 5^oС. рН элюента 9,5. На выходе из колонны собирают фракции объемом 5 л, в которых определяют количество белка по методу Лоури, фракции, содержащие более 10 мг/мл белка объединяют, доводят рН элюата до 3,0 и производят в нем осаждение ферментов методом дробного высаливания сернокислым аммонием по действующей технологии.

П р и м е р 2. Экстракцию ферментов из поджелудочной железы и сепарирование экстракта осуществляют как описано в примере 1. После чего экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макросетчатым карбоксильным катионитом СГ-1М в Н⁺-форме в количестве 15 кг. Скорость сорбции 90 мл/см² ч. Объем пропущенного экстракта 105 л, рН 3,0. Затем сорбент промывают 15 л подкисленной водой с рН 3,0 и проводят десорбцию ферментов 0,1 н. раствором сульфата аммония в 0,3 н. растворе аммиака с рН 10,0, подавая элюент сверху вниз со скоростью 45 мл/см² ч при 5^oC. Далее действуют аналогично примеру 1.

Использование: биотехнология, в частности производство ферментов из животного сырья. Сущность изобретения: предварительно измельченное животное сырье подвергают кислотной экстракции. Затем экстракт последовательно подвергают центрифугированию, сепарированию, ионообменной сорбции на макропористом сорбенте с pH 1,5 - 3,0 с последующей элюцией ферментов с носителя раствором сернокислого аммония в аммиаке с pH 9,0 - 10,0. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий измельчение животного сырья, кислотную экстракцию, отделение экстракта от жмыха и выделение ферментов из экстракта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, увеличения выхода и улучшения качества ферментов, отделенный от жмыха экстракт сепарируют, а выделение осуществляют сорбцией ферментов на макропористом сорбенте при рН 1,5 - 3,0 с последующей элюцией ферментов раствором сернокислого аммония в аммиаке с рН 9 - 10. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию проводят в течение 3 - 5 ч. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют макропористый сульфо- или макросетчатый карбоксильный катионит. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве элюента используют 0,1 - 1,0 н раствор сульфата аммония в 0,3 -0,01 н растворе аммиака.