Способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота Российский патент 2018 года по МПК C12N9/26 C12N9/24 

Предлагаемое изобретение относится к производству ферментов, а именно к способу получения гиалуронидазы из животного сырья - семенников крупного рогатого скота (КРС).

Известны способы получения отдельных ферментов из животного сырья с использованием экстракционных, сорбционных и других методов выделения [1, 2].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является промышленный способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота путем экстракции в течение 4 ч с последующим отделением от жмыха, дробным осаждением и фильтрацией, промывкой ацетоном осадка и подсушиванием [3].

Недостатком указанного способа получения гиалуронидазы является использование ацетона крепости 99% на стадии осаждения в экстракте балластных белков с последующим сепарированием, на стадии осаждения целевого продукта ацетоном с отстаиванием в течение 4 ч и последующей фильтрацией на нутч-фильтре, на стадии промывки полученного осадка целевого продукта ацетоном на нутч-фильтре до тех пор, пока продукт не будет комковаться с последующей окончательной сушкой под вытяжным шкафом в течение 5-7 дней до полного удаления запаха. Следовательно, производственный участок относится к категории А по взрывопожароопасности, а условия труда являются вредными. Длительность процесса составляет в среднем 3-4 недели. Указанные недостатки значительно сокращают эффективность и экономичность технологического процесса.

Целью предлагаемого изобретения является проведение процесса без использования органических растворителей для осаждения балластных веществ и целевого продукта, сокращение времени процесса получения фермента, увеличение его выхода и улучшение качества за счет отсутствия в технологии взрыво- и пожароопасных веществ.

Цель достигается использованием способа получения гиалуронидазы, который включает следующие стадии. Подготовленное сырье измельчают и экстрагируют 0,1н раствором уксусной кислоты в соотношении 1:2 (сырье:экстрагент) при перемешивании и пониженной температуре в течении 4 ч. Гомогенат центрифугируют/сепарируют. Прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну с сорбентом с определенной скоростью, сорбцию целевого продукта ведут из экстракта на макропористых сульфокатионитах - сополимерах стирола и дивинилбензола. Увеличение и уменьшение скорости сорбции вне указанного интервала существенно не влияет на процесс. Катеонит предварительно уравновешивают раствором с рН 4,0-4,5, содержащим ионы аммония. После завершения сорбции катеонит промывают буферным раствором/подкисленной водой с рН=3,5-4,5 с определенной скоростью в количестве, равном пяти свободным объемам колонны. Затем осуществляют десорбцию фермента с ионита путем подачи сверху вниз элюента с рН 10.0-11.0 с определенной скоростью. Уменьшение скорости подачи элюента и изменение рН элюента меньше 10,0 приводит к "размыванию" целевого пика, увеличению его объема, что не дает достаточной степени концентрирования. Изменение рН элюента больше 11,0 приводит к десорбции с ионита примесей и, как следствие, к ухудшению качества продукта.

Предпочтительно изобретение относится к описанному выше способу, в котором для отделения балластных белклов и коцентрирования целевого продукта применен сорбционно-хроматографический метод на макропористых сорбентах различных марок: КУ-23, Nuvia S, Macro Prep.

Отличительными признаками предложенного способа от прототипа является:

1. Концентрирование целевого продукта на сульфокатионитах.

2. Отсутствие стадий: а) осаждения ацетоном: балластных белков и целевого продукта; б) промывки ацетоном

3. Отсутствие длительной стадии удаления паров ацетона в вытяжном шкафу. Положительный эффект от предложенного технического решения состоит в следующем:

1. Сокращение технологического цикла получения фермента в 2 раза.

2. Увеличение съема фермента с единицы сырья в 1,5-2 раза.

3. Улучшение качества готового продукта и условий труда работников за счет исключения использования ацетона.

Способ иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1

Взвешивают 150 г семенников КРС. Измельченное сырье помещают в колбу объемом 500 мл, добавляют 300 мл экстрагента - 0,1н уксусной кислоты. Ставят экстрагироваться на холоду (2-8°С) на 4 ч при перемешивании на шейкере. Гомогенат центрифугируют (3000 об/мин, 20 мин, 2-8°С). Катеонит предварительно уравновешивают 0,1н раствором NH₄Cl с рН=4,3. После отделения осадка проводят сорбцию целевого продукта из экстракта на макропористом сульфокатионите КУ-23 со скоростью 220 мл/см²ч до проскока целевого продукта. После завершения сорбции катионит КУ-23 промывают подкисленной водой с рН=3,5. Элюцию проводят 1н раствором сульфата аммония с рН=10,5 со скоростью 80 мл/см²ч. Отбирают пробы в количестве 10 мл и определяют концентрацию белка по методу Лоури. Сорбент промывают водой и регенерируют.

Общий выход по белку на стадии десорбции составил 91%. Степень концентрирования по активности при использовании в качестве сорбента КУ-23 составила 1,05.

Пример 2

Взвешивают 100 г семенников КРС. Измельченное сырье помещают в колбу объемом 500 мл, добавляют 200 мл экстрагента - 0,1н уксусной кислоты. Ставят экстрагироваться на холоду (2-8°С) на 4 ч при перемешивании на шейкере. Гомогенат центрифугируют (3000 об/мин, 20 мин, 2-8°С). После отделения осадка проводят сорбцию целевого продукта из экстракта в количестве 25 мл на макропористом сульфокатионите Nuvia S со скоростью 210 мл/см²ч до проскока целевого продукта. После завершения сорбции катионит Nuvia S промывают ацетатным буфером с рН 4.0-4,5 со скоростью 210 мл/см²ч. Элюцию проводят аммиачным раствором с рН 10.0-11.0 со скоростью 105 мл/см²ч. Отбирают пробы в количестве 1 мл и определяют концентрацию белка биуретовым методом. Сорбент промывают водой и регенерируют.

Общий выход на белку на стадии десорбции составил 67%. Степень концентрирования по активности при использовании в качестве сорбента Nuvia S составила 2,16.

Пример 3

Взвешивают 100 г семенников КРС. Измельченное сырье помещают в колбу объемом 500 мл, добавляют 200 мл экстрагента - 0,1н уксусной кислоты. Ставят экстрагироваться на холоду (2-8°С) на 4 ч при перемешивании на шейкере. Гомогенат центрифугируют (3000 об/мин, 20 мин, 2-8°С). После отделения осадка проводят сорбцию целевого продукта из экстракта в количестве 25 мл на макропористом сульфокатионите Macro Prep со скоростью 210 мл/см²ч до проскока целевого продукта. После завершения сорбции катионит Macro Prep промывают ацетатным буфером с рН 4.0-4,5 со скоростью 210 мл/см²ч. Элюцию проводят аммиачным раствором с рН 10.0-11.0 со скоростью 105 мл/см²ч. Отбирают пробы в количестве 1 мл и определяют концентрацию белка биуретовым методом. Сорбент промывают водой и регенерируют.

Общий выход на белку на стадии десорбции составил 63%. Степень концентрирования по активности при использовании в качестве сорбента Macro Prep составила 1,0.

Источники информации

1. Патент 2495672 РФ Способ получения комплекса биологически активных веществ из печени рыб тресковых пород / Забозлаев А.А. (RU), Пожарицкая О.Н (RU), Шиков А.Н. и др. // Опубл. 20.10.2013.

2. Патент 2570631 РФ Способ получения пероксидазы / Иванов В.Н. (RU), Глазова Н.В. (RU), Серкова А.Н. (RU) и др. // Опубл. 20.04.2015.

3. Патент 827068 СССР Способ получения лидазы / Лазарева И.В., Сидорова Н.Д., Чайка О.В. и др. // Опубл. 07.05.1981.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота. Способ включает экстракцию измельченного сырья 0,1н раствором уксусной кислоты в течение 4 ч. Затем экстракт последовательно подвергают центрифугированию/сепарированию, ионообменной сорбции на макропористом сульфокатионите с последующей элюцией фермента с носителя аммиачным элюентом рН 10.0-11.0 при скорости элюции 80-120 мл/см²ч. Изобретение обеспечивает увеличение выхода и улучшение качества целевого продукта. 5 з.п. ф-лы, 4 пр.

1. Способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота, заключающийся в экстракции предварительно измельченного сырья 0,1н раствором уксусной кислоты в соотношении 1:2 в течение 4 ч при температуре 2°C-8°C с последующим сепарированием/центрифугированием для получения прозрачного экстракта, сорбции полученного экстракта на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом со скоростью 180-220 мл/см²ч с последующей промывкой подкисленной водой или буферным раствором с рН=3,5-4,5 в количестве, равном пяти свободным объемам колонны, и элюции аммиачным элюентом с рН=10-11 со скоростью 80-120 мл/см²ч для получения элюата.

2. Способ по п. 1, при котором в качестве макропористого сульфокатионита используют сорбент марки КУ-23.

3. Способ по п. 1, при котором в качестве макропористого сульфокатионита используют сорбент марки Nuvia S.

4. Способ по п. 1, при котором в качестве макропористого сульфокатионита используют сорбент марки Macro Prep.

5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором в качестве элюента используют аммиачный раствор с рН 10,0-11,0.

6. Способ по любому из пп. 1-4, при котором в качестве элюента используют сульфат аммония с рН 10,0-11,0.