ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS PUMILUS, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЭНДОНУКЛЕАЗУ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩУЮ И РАСЩЕПЛЯЮЩУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5` = CCTNAGC-3` Российский патент 1994 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-ССТNAGC-3'.

Рестриктаза такой специфичности описана впервые и может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Bacillus sphaericus, продуцирующий рестриктазу Bsi I (сайт узнавания 5'-СTCGТG-3') [1].

Основным недостатком штамма является его неспособность продуцировать рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-CCTNAGС-3'.

Известен штамм Bacillus species 21, продуцирующий рестриктазу Bse21 I (сайт узнавания 5'-ССTNAGG-3') [2].

Недостатком данного штамма является его неспособность продуцировать рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-ССTNAGC-3'.

Наиболее близким к заявленному штамму является штамм Bacillus pumilus, продуцирующий рестриктазу BpuI [3], узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-G(A/G)GC(Т/C)C-3'.

Однако и этот штамм не способен продуцировать рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-CCТNAGC-3'.

Технической задачей изобретения является получение штамма-продуцента рестриктазы, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5'-CCTNAGC-3'.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Bacillus pumilus - продуцента сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции Bpu10I.

Предлагаемый штамм выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Bacillus pumilus депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-5464, а продуцируемая им рестриктаза названа Bpu10 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus pumilus характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые, 0,5-0,7x2-3 мкм, подвижные. Образуют эндоспоры эллиптической формы, расположенные центрально, вздутости относительно размеров вегетативной клетки не обнаружено. Окраска по Граму - грамположительны.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПA, МПA, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие, круглые, белесые колонии, блестящие, с ровным краем.

Оптимальная температура роста 37^oC, рН 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70^оС или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки штамма.

Не восстанавливает нитраты, образует ацетоин; не гидролизует крахмал, но гидролизует казеин, гиппурат, растет при концентрации NaCl до 7%, 0,001% лизоцима; энергично образует кислоту из глюкозы, но без газа, не растет в анаэробном агаре.

Для культивирования Bacillus pumilus B-5464 применяют среду следующего состава в г/л - пептон-10, дрожжевой экстракт-5, глюкоза-5, вода дистиллированная - остальное. Культивирование проводят при 37^oC и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента 200 ед/г сырой биомассы с активностью 3000 ед/мл.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является:
- наличие эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-ССTNAGC-3'.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые, в литературе аналогичного штамма или любого другого, продуцирующего эндонуклеазу рестрикции, имеющей сайт узнавания 5'-CCТNAGC-3', не описано, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "существенные отличия".

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага λ ферментом Bme18 I (дор.1) и ферментом Bpu10 I (дор.2).

В таблице представлены теоретические длины фрагментов ДНК фага Т7 для последовательности 5'-CCТNAGC-3' и экспериментальные данные, полученные при гидролизе Bpu10 I. Совпадение теоретических и экспериментальных данных подтверждает, что местом узнавания фермента является последовательность нуклеотидов 5'- CCТNAGC-3'.

П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 32^oC. После 10-12-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): пептон-10; дрожжевой экстракт (Difco)-5; глюкоза-5; вода дистиллированная - остальное. Культивирование проводят при 32^oC с аэрацией 2 объема/мин, при перемешивании -150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^oC. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber.

П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине гидролиза субстратной ДНК, сравнивая длины фрагментов (см.таблица), полученных при гидролизе Bpu10 I и теоретические длины для последовательности 5' -ССТNАGC-3'. В качестве субстратной ДНК использовали ДНК фага Т7. Совпадение теоретических и экспериментальных результатов говорит о том, что этот фермент узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5'-ССТNAGC-3'.

Выход фермента Bpu10 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 37^oC.

Выход фермента составляет 200 ед/г cырой биомассы, удельная активность 1.000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^oC в глицерине.

Определяющим отличием полученного штамма по сравнению с известными является его способность продуцировать эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую уникальную последовательность нулеотидов 5'-CCTNАGC-3'.

Эндонуклеаза рестрикции с такой специфичностью описана впервые. Использование ее повышает возможности экспериментаторов в генно-инженерных работах, картировании геномов, является удобной моделью при исследовании специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Использование: биотехнология, генная инженерия, выделенный фермент повышает возможности экспериментаторов в генно-инженерных работах, картировании геномов, является удобной моделью при исследовании специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий. Сущность изобретения: выявлен штамм Bacillus pumilus ВКПМ Б 5464 - продуцент рестриктазы Ври 101, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′-CCTNAGG-3′ . Штамм выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз. Штамм растет на простой, доступной и дешевой среде. Выход фермента составляет 200 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 1000 ед/мл. Штамм обеспечивает продукцию рестриктазы, имеющей уникальный сайт узнавания и расщепления последовательности нуклеотидов 5′-CCTNAGG-3′ . 1 ил., 1 табл.

Штамм бактерий Bacillus pumilus ВКПМ В-5464, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-CCTNAGC-3'.