ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SCHLEGELII - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5' - CCNNNNNNN GG-3' Российский патент 1997 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/08 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5^'-CCNNNNNNNGG-3^'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Bacillus species M, продуцирующий рестриктазы BspV 1 и BspM II (сайты узнавания 5^'-ACCTGC-3^' и 5^'-TCCGGA-3^', соответственно) [1] Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5^'-CCNNNNNNNGG-3^'. Обе эти рестриктазы являются термолабильными. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Известен штамм Bacillus caldolyticus, продуцирующий рестриктазу Bcl I (сайт узнавания 5^'-TGATCA-3^') [2] Данная рестриктаза является термостабильной. Недостатком данного штамма является то, что он имеет прочную клеточную оболочку. Для разрушения требуется несколько актов дезынтеграции. Кроме того, рестриктаза, выделенная из данного штамма не способна расщеплять последовательность неклеотидов 5^'-CCNNNNNNNGG-3^'.

Наиболее близким к заявляемому штамму прототипом, является штамм Bacillus stearothermophilus, продуцирующий рестриктазу Bsi Y I, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5^'-CCNNNNNNNGG-3^' [3]
Для культивирования этого штамма требуется традиционная богатая среда, культивирование ведется при температуре 60^oС. Продуцируемая им рестриктаза является термостабильной. Недостатками данного штамма является то, что выход рестриктазы не превышает 1000 ед/г сырой биомассы.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5^'-CCNNNNNNN- 3^', с высоким выходом фермента.

Поставленная цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus schlegelii 4 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bsc 4 I.

Предлагаемый штамм выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Basillus chilegelii 4 депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-6310, а продуцируемая им рестриктаза названа Bsc4 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus schlegelii характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые, 0,5 0,6 х 1,5 2 мкл, очень подвижные. Расположены одиночно, парами и в коротких цепочках. Образуют эндоспоры сферической формы, расположенные преимущественно терминально или субтерминально, превышают размеры вегетативной клетки, напоминают по форме барабанную палочку.

Окраска по Граму грамположительны.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует округлые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем, на влажных агаризованных пластинах образуют равномерный газон.

Оптимальная температура роста 60^oС, но наблюдается рост и при 37^oС, рН 7,0 7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при 70^oС или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, казеин; каталазоположителен; не растет при концентрации NaCl 5% на 0,002% азиде натрия и на среде Сабуро, не наблюдали роста в анаэробном агаре.

Для культивирования Bacillus schlegelii В-6310 применяют среду следующего состава (г/л): пептон 10, дрожжевой экстракт 3, глюкоза 5, вода дистиллировання остальное. Культивирование проводят при 60^oС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента 5000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 10000 ед/мл.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются его высокая продуктивность.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5^'-CCNNNNNNNGG- 3^', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Изобретение иллюстрируется следующей фигурой графического изображения.

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bsc4 I (дор.1), Bsc4 I и Bsl I (New England Biolabs, сайт узнавания 5^'-CCNNNNNNNGG- 3^') (дор.2), Bsl I (дор. 3), фаг лямбда (дор. 4).

Как видно из представленной фигуры, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 60^oС. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л):
пептон 10, дрожжевой экстракт (Difco) 3, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60^oС с аэрацией 1,5 объем/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^oС. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber [4]
Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1 3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5^'-CCNNNNNNNGG-3^'.

Выход фермента Bsc 4 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 60^oС. Выход фермента составляет 5.000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 10.000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^oС в глицерине.

Таким образом, получен штамм, обладающий следующим преимуществом по сравнением с известным:
высокая продуктивность штамма;
Поскольку рестриктаза Bsc 4 I имеет сайт узнавания 5^'- CCNNNNNNNGG-3^', идентичный сайту узнавания рестриктазы Bsi Y I, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Использование: микробиология и биотехнология, касается штамма-продуцента, обеспечивающего получение термостабильной рестриктазы, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5^'-CCNNNNNNNGG-3^', с высоким выходом и активностью фермента. Сущность изобретения: предложен новых штамм Bacillus schlegelii (ВКПМ В-6310) - продуцент рестриктазы Bsc4 1, выделенный из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз. Выход фермента составляет 5000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 10000 ед/мл. Рестриктаза Bsc 4 1 является изошизомером рестриктазы Bsi Y 1 и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.

Штамм бактерий Bacillus schlegelii ВКПМ В-6310 продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-CCNNNNNNNGG-3'.