ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS COAGULANS - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5'-GATNNNNATC-3' Российский патент 1996 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GAТNNNNAТС-3'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Bacillus species М, продуцирующий рестриктазы BspM I и BspM II (сайты узнавания 5'-ACCТGC-3' и 5'ТССGGA-3', соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'GAТNNNNАТС-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Известен штамм Microbacterium ammoniaphilus, продуцирующий рестриктазу Mam I (сайт узнавания 5'GAТNNNNAТС-3') [2]
Недостатком данного штамма является термолабильность эндонуклеазы рестрикции. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы.

Наиболее близким к заявленному штамму прототипом, является штамм Bacillus stearothermophilus, продуцирующий рестриктазу BsaB I [3] узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'GAТNNNNAТС-3'. Для культивирования этого штамма требуется традиционная богатая среда, культивирование ведется при 55^оС. Продуцируемая им рестриктаза является термостабильной.

Недостатками данного штамма является то, что выход рестриктазы не превышает 1000 ед/г cырой биомассы.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-GAТNNNNAТС-3', с высоким выходом фермента.

Цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus coagulans 631 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bcо631 I.

Предлагаемый штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Bacillus coagulans 631 депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-6670, а продуцируемая им рестриктаза названа Bco631 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus cоаgulans характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, 0,5-0,8 х 2-12 мкл, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные преимущественно центрально и терминально, превышают размеры вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.

Культуральные признаки. Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, MПА, MПБ). На агаризованных средах образует круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.

Оптимальная температура роста 60^оС, рН 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70^оС или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки. Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, казеин, желатин; каталазоположителен; растет при концентрации NaCl до 5% cлабо растет на 0,002% азиде натрия и на среде Сабуро, не наблюдали роста в анаэробном агаре, если не добавлять в среду триптон; индолотрицателен.

Для культивирования Bacillus cоagulans B-6670 применяют среду следующего состава (г/л): пептон 10, дрожжевой экстракт 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60^оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента 6 000 ед/г cырой биомассы с удельной активностью 10000 ед/мл.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является его высокая продуктивность.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-GAТNNNNAТС-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bcо631 I (дор.1), Bcо631 I и BsaB I (New England Biolabs) (дор.2), BsaB I (дор.3), фаг лямбда (дор.4).

Как видно идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 60^оС. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): пептон 10; дрожжевой экстракт (Difco) 5; глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60^оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании ^_ 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^оС. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber [4]
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (см.чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-GAТNNNNAТС-3'.

Выход фермента Bco631 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 60^оС. Выход фермента составляет 6.000 ед/г cырой биомассы, удельная активность 10.000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^оС в глицерине.

Таким образом, получен штамм, обладающий следующим преимуществом по сравнению с известным:
высокая продуктивность штамма.

Поскольку рестриктаза Bco631 I имеет сайт узнавания 5'-GAТNNNNАТС-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы BsaB 1, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Использование: микробиология и биотехнология для получения термостабильной рестриктазы, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5′-GATNNNNATC- 3′, с высоким выходом и активностью фермента. Сущность изобретения: предложен новый штамм Bacillus coagulans (ВКПМ В-6670) - продуцент рестриктазы Bco631 I, выделенный из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз. Положительный эффект: выход фермента составляет 6000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 10000 ед/мл. Рестриктаза Bco631 I является изошизомером рестриктазы BsaB I и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.

Штамм бактерий Bacillus coagulans ВКПМ В-6670 продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-GATNNNNATC-3′.