ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SPECIES - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5`-(A/G) CCGG (T/C)-3` Российский патент 1995 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-(A/G) CCGG (T/C) 3'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Bacillus species M. продуцирующий рестриктазы BspM I и BspM II (сайты узнавания 5' ACCTGC 3' и 5' TCCGGA 3', соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся две рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5' (A/G)CCGG(T/C)-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Известен штамм Bacillus stearothermophilus, продуциpующий рестриктазу BsrF I (сайт узнавания 5' (A/G)CCGG(T/C) 3') [2]
Недостатком данного штамма является низкий выход эндонуклеазы рестрикции. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы.

Наиболее близким к заявленному штамму прототипом является штамм Citrobacter freundii, продуцирующий рестриктазу Cfr10 I [3]
Недостатком данного штамма является то, что продуцируемая им рестриктаза является термолабильной. Выход рестриктазы не превышает 300 ед/г сырой биомассы. Штаммы данного вида относятся к энтеробактериям, некоторые серотипы встречаются при массовых пищевых токсикоинфекциях, при инфекциях мочевых путей, желчного пузыря, среднего уха и мозговых оболочек.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5' -(A/G)CCGG(T/C) 3', с высоким выходом и активностью фермента.

Цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus specis118 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bse118 l.

Предлагаемый штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Bacillus species118 депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-5941, а продуцируемая им рестриктаза названа Bse118 l согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus species118 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые, 0,5-0,8х2-12 мкм, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные центрально и терминально, вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие, круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.

Оптимальная температура роста 60^оС, рН 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70^оС или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауера; не гидролизует крахмал, казеин, желатин; каталазоположителен, растет при концентрации NaCl до 5% 0,002% азида натрия, на среде Сабуро, не наблюдали роста в анаэробном агаре; устойчив к стрептомицину.

Для культивирования Bacillus species B-5941 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10, дрожжевой экстракт 5; глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60^оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента 4000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 10000 ед/мл.

Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются следующие:
наличие термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.

Поскольку предлагаемый штамм получены впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-(A/G)CCGG(T/C)-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "Новизна" и "Изобретательский уровень".

Электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bst118 I, Cfr10 I и Bse118 I, Cfr10 I представляет идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе, подтверждает их изошизомерию.

П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 60^оС. После 10-12-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт (Difco) 5, глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 60^оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^оС. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber.

П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК. Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-(A/G)CCGG(T/C)-3'.

Выход фермента Bse118 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 60^оС. Выход фермента составляет 4000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 10000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^оС в глицерине.

Таким образом, получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным:
наличие единственной термостабильной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.

Поскольку рестриктаза Bse118 I имеет сайт узнавания 5'-(A/G)CCGG(T/C)-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Cfr10 I, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: выявление штамма-продуцента Bacillus species, обеспечивающего получение термостабильной эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность 5′-(A/G) CCGG(T/C)-3′ с высоким выходом и активностью фермента. Штамм Bacillus species ВКПМ - В 5941 выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз. Положительный эффект: выход фермента составляет 4000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 10000 ед/мл. Рестриктаза Bse 118 1 является изошизомером рестриктазы Cfr 10 1 и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах.

Штамм бактерий Bacillus species ВКПМ В-5941 продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5′ (A/G) CC GG (T/C) 3′.