ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS PUMILUS - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ВРИ 19 1 Российский патент 1995 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-ССАТGG-3'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Bacillus species M, продуцирующий рестриктазы BspM 1 и BspM II (сайты узнавания 5'-АССTGC-3' и 5'-ТССGGa-3', соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся две рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-ССАTGG-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Известен штамм Bacillus pumilus, продуцирующий рестриктазу Bpul [2] узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-G(A/G)GC(T/C)C-3'. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы. Однако и этот штамм не способен продуцировать рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-ССАТGG-3'.

Наиболее близким к заявленному штамму прототипом является штамм Nostoc species SA, продуцирующий рестриктазу NspSA III [3] узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-ССАТGG-3'. Этот штамм относится к цианобактериям, имеет клеточную стенку, состоящую из муреина, способен к фотосинтезу. Биомассу можно разрушать лизоцимом.

Недостатком данного штамма является то, что выход продуцируемой им рестриктазы NspSA III не превышает 500 ед/г сырой биомассы. Для очистки фермента требуются специальные методы, так как данном штамме содержатся четыре различные по специфичности рестриктазы. Штаммы данного вида требуют специальных условий культивирования и режимов подсветки.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего единственную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-ССАЕGG-3' с высоким выходом и активностью фермента.

Цель достигается выявлением и использованием штамма Bacilllus pumilus продуцента сайт-специфической рестриктазы Вpu19 I.

Предлагаемый штамм выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Bacillus pumilus депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-6308, а продуцируемая им рестриктаза названа Bpu19 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus pumilus характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, округлые, мелкие, 0,5-0,7х3,5 мкм, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные в основном центрально, не превышающие размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (CПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.

Оптимальная температура роста 37^оС, рН 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при 70^оС или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; не гидролизует крахмал, гидролизует казеин; каталазоположителен; растет при концентрации NaCl до 7% слабо растет на 0,002% азиде натрия и на среде Сабуро, не наблюдали роста в анаэробном агаре.

Для культивирования Ваcillus pumilus B-6308 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт 5; глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 37^оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента 5000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 20000 ед/мл.

Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются следующие:
наличие единственной рестриктазы;
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-ССАТGG-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "Новизна" и "Изобретательский уровень".

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Bsu19 I (дор. 1), Bsu19 I и Nco I (сайт узнавания 5'-ССАТGG-3', Boehringer Mannheim) (дор. 2), Nco I (дор. 3).

Как видно из представленного чертежа, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 37^оС. После 10-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт (Difco) 5; глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 37^оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^оС. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber [4]
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК (чертеж). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-CCATGG-3'.

Выход фермента Bpu19 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37^оС. Выход фермента составляет 5000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 20000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^оС в глицерине.

Таким образом, получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным:
наличие единственной рестриктазы:
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.

Поскольку рестриктаза Bpu19 I имеет сайт узнавания 5'-ССАТGG-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы NspSA III, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Использование: микробиология и биотехнология, для получения эндуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5′-CCATGG-3′ с высоким выходом и активностью фермента. Сущность изобретения: предложен новый штамм Bacillus pumilus (ВКПМ В-6308) продуцент рестриктазы Ври19 1, выделенный из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз. Положительный эффект: выход фермента составляет 5000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 20000 ед/мл. Рестриктаза Ври19 1 является изошизомером рестриктазы NspSA III и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.

Штамм бактерий Bacillus pumilus ВКПМ В-6308 продуцент эндонуклеазы рестрикции Bpu 19 1.