ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS BADIUS - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3' Российский патент 1996 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5' -(A/T)CCGG(T/A) 3'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Bacillus species М, продуцирующий рестриктазы BspM I и BspM II (сайты узнавания 5'-ACCTGC-3' и 5'-TCCGGA-3', соответственно) [1] Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 2 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-(A/T)CCGG(T/A)-3'. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Известен штамм Citrobacter freundii, продуцирующий рестриктазу Cfr10 I (сайт узнавания 5'-(A/G)CCGG(T/C)) [2] Недостатком данного штамма является его низкая продуктивность. Выход рестриктазы не превышает 300 ед/г сырой биомассы. Штаммы данного вида относятся к энтеробактериям, некоторые серотипы встречаются при массовых пищевых токсикоинфекциях, при инфекциях мочевых путей, желчного пузыря, среднего уха и мозговых оболочек. Этот штамм также не способен продуцировать рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3'. Данные по биотехнологическим показателям штамма не опубликованы.

Наиболее близким к заявленному штамму прототипом является штамм Brevibacterium acetyliticum, продуцирующий рестриктазу Bet I (сайт узнавания 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3') [3]
Недостатками данного штамма является низкий выход рестриктазы, составляющий менее 200 ед/г, наличие неспецифического нуклеазного загрязнения, что не позволяет сделать фермент, выделяемый из данного штамма, коммерческим препаратом. Для культивирования необходима богатая среда: Nutrient agar ("Difco", USA). Выращивание штаммов данного вида для выделения эндонуклеаз рестрикции длится 72-120 ч [4]
Целью изобретения является получение штамма, продуцирующего рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3', высокопродуктивного по искомой эндоклеазе, неприхотливого к питательным средам, не требующего длительного культивирования.

Цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus badius 179 продуцента сайт-специфической рестриктазы, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3'.

Предлагаемый штамм выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Bacillus badius 179 депонирован в ВКПМ НИИ генетика под регистрационным номером B-6616, а продуцируемая им рестриктаза названа Bda179 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus badius характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые, 0,5-0,8х2-12 мкл, подвижные. Образуют эндоспоры эллиптической формы, расположенные центрально и терминально, вздутости относительно размеров вегетативной клетки не наблюдается.

Окраска по Граму грамположительны.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПВ). На агаризованных средах образует мелкие, круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.

Оптимальная температура роста 37^оС, pH 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при 70^оС или в лиофольно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Не восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауэра; гидролизует крахмал, желатин, но не гидролизует казеин; каталазоположителен; не растет при концентрации NaCl выше 5% слабый рост при 0,002% азида натрия и на среде Сабуро, нет роста в анаэробном агаре; индолотрицателен.

Для культивирования Bacillus badius B-6616 применяют СПА, МПА, МПБ. Культивирование проводят на термостатированных качалках или в ферментерах при 37^оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста (4-5 ч).

Выход целевого фермента 1000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 3,000 ед/мл.

Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются: в 5 раз более высокая продуктивность по целевому ферменту; отсутствие нуклеазного загрязнения; простая питательная среда; высокая скорость роста.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям "Новизна" и "Изобретательский уровень".

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Avall (дор. 1,5) маркерный гидролиз и продукты гидролиза ДНК pBR322 ферментом Bda179 I (дор.2), Bba179 I совместно с BsaW I (сайт узнавания 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3') (дор. 3), BsaW I (дор. 4).

Как видно из чертежа, идентичность полос расщепления при параллельном и последовательном гидролизе подтверждает их изошизомерию.

П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 37^оС. После 10-12-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой (МПВ). Культивирование проводят в ферментере при 37^оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 150 об/мин, до фазы замедления роста (4-5 ч). Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^оС. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber.

П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного гидролиза субстратной ДНК. Совпадение длин фрагментов гидролиза говорит о том, что Bba179 I узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов: 5'-(A/T)CCGG(A/Т)-3'.

Выход фермента Bba179 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37^оС. Выход фермента составляет 1,000 ег/г сырой биомассы, удельная активность 3,000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^оС в глицерине.

Таким образом получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным: более высокая продуктивность по целевому ферменту; отсутствие нуклеазного загрязнения; простая питательная среда; высокая скорость роста.

Поскольку рестриктаза Bba179 I имеет сайт узнавания 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Bet I, а выход фермента высок, она может стать коммерческим препаратом и применяться во всех генно-инженерных работах для расщепления последовательности нуклеотидов 5'-(A/T)CCGG(A/T)-3'.

Использование: микробиология и биотехнология в генно-инженерных работах. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus badius ВКПМ В-6616 обеспечивает получение рестриктазы Вba 179 1, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5′= (A/T)CCGG(A/T)-3′, не требовательный к питательным средам и с небольшим временем культивирования. Штамм Bacillus badius ВКПМ В-6616 выделен из почвы в результате поиска продуцентов рестриктаз. Выход фермента составляет 1000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 3000 ед/мл. Рестриктаза Bba 179 1 является изошизомером рестриктазы Bet 1. 1 ил.

Штамм бактерий Bacillus badius ВКПМ В-6616 - продуцент эндонуклеазы реструкции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-(A/T)CCGG(A/T)-3′.