ШТАММ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER CALCOACETICUS - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5`-GGTACC-3` Российский патент 1995 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 C12N9/14 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GGTACC-3'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Acinetobacter calcoaceticus, продуцирующий рестриктазы AccI, AccII и AccIII (сайты узнавания 5'-GTMKAC-3', 5'-CGCG-3' и 5'-TCCGGA-3', соответственно) [1]
Недостатком данного штамма является то, что в одной биомассе находятся 3 рестриктазы. Это затрудняет процедуру очистки, причем ни одна из рестриктаз не способна узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-GGTACC-3'.

Известен штамм Achromobacter species718, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-GGTACC-3' [2]
Недостатками данного штамма является высокая продолжительность культивирования (10 ч), при этом выход биомассы составляет 0,2 г/л. При разрушении биомассы применяют специальное оборудование (French press).

Наиболее близким к заявленному штамму прототипом, является штамм Klebsiella pneumoniae, продуцирующий рестриктазу Кpn I [3] Данный штамм продуцирует одну эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-GGTACC-3'. Выход фермента составляет 50.000 ед/г сырой биомассы.

Основным недостатком данного штамма является его патогенность. Микроб является обитателем слизистых оболочек дыхательных путей. Вызывает пневмонию, гнойные процессы, циститы. При получении биомассы необходимо соблюдение специальных правил безопасности.

Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-GGTACC-3', с высоким выходом фермента, не требующего специальных условий для получения биомассы, непатогенного для человека.

Цель достигается выявлением и использованием штамма Acinetobacter calcoaceticus продуцента сайт-специфической рестриктазы Acc65 I.

Предлагаемый штамм выделен в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Acinetobacter calcoaceticus является непатогенным и депонирован в ВКПМ НИИ генетика под регистрационным номером В-6337, а продуцируемая им рестриктаза названа Acc65 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Acinetobacter calcoaceticus характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые и толстые (1,0-1,5 х 1,5-2,5 мкм) в логарифмической фазе роста и почти кокковые в стационаре. Преимущественно в парах иногда в цепочках. Не образуют эндоспор и жгутиков. Окраска по Граму грамотрицательны.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА,МПА,МПБ). На агаризованных средах образует мелкие, круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.

Оптимальная температура роста 30^оС, рН 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при 70^оС или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Отрицателен в реакции Фогес-Проскауэра; не образует индол и H₂S; каталазоположителен; оксидазоотрицателен. Образует кислоту из глюкозы, не наблюдали роста в анаэробном агаре; устойчив к пенициллину.

Для культивирования Acinetobacter calcoaceticus применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт 5; глюкоза 5; вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 30^оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента 60,000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 10.000-100.000 ед/мл.

Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются:
непатогенность,
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента;
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-GGTACC-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментом Acc65I (дор.1), Acc65I и KpnI (дор.2), KpnI (дор.3).

Идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизометрию.

П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 30^оС. После 10-12-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л) пептон 10, дрожжевой экстракт (Difco) 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 30^оС с аэрацией 1,5 объема/мин, при перемешивании 250 об/мин, до фазы замедления роста (3-5 ч). Клетки собирают центрифугированием при 1500g и температуре 1^оС. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводили по методике Bickle, Pirotta, Imber [4]
П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК. Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-GGTACC-3'.

Выход фермента Acc65I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 37^оС. Выход фермента составляет 60.000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 100.000 ед/мл.

Фермент хранится при 20^оС в глицерине.

Таким образом, получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным:
непатогенность,
высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента;
Поскольку рестриктаза Acc65 I имеет сайт узнавания 5'-GGTACC-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы Kpn I, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Использование: микробиология и биотехнология. Сущность изобретения: выявление штамма-продуцента Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ В-6337, непатогенного и обеспечивающего получение рестриктазы, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5′-GGTACC-3′ , с высоким выходом и активностью фермента. Выход фермента составляет 60000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 10000 - 100000 ед/мл. Рестриктаза Асс 651 является изошизомером рестриктазы Kpn 1 и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.

Штамм бактерий Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ В-6337 продуцент эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-GGTACC-3′.