СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТИНЭСТЕРАЗЫ Российский патент 1994 года по МПК C12N9/18 C12N13/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству очищенного фермента пектинэстеразы (ПЭ), применяемого в кондитерской промышленности при производстве низкокалорийной продукции.

Цель изобретения - повышение выхода ПЭ.

Способ заключается в обработке раствора комплексного пектолитического ферментного препарата в катодном прост- ранстве диафрагменного электролизера при плотности тока 0,05-30,00 мА/см² до достижения рН 10,5-11,5, выдерживании, отделении осадка, доведении рН до 4,5-5,5 и выделении целевого продукта, причем против раствора комплексного пектолитического ферментного препарата используют водный раствор натриевой соли неорганической кислоты в концентрации 0,3-2,0%.

Обработку комплексного пектолитического ферментного препарата изменением рН до 10,5-11,5 проводят для инактивации и осаждения присутствующей в препарате полигалактуроназы (ПГ). Наложение постоянного электрического тока обеспечивает равномерный во всем объеме сдвиг рН ферментного раствора, изменение заряда белков, их агрегацию и выпадение в осадок, что обеспечивает удаление щелочелабильных белков, в том числе ПГ, при максимальном сохранении ПЭ в растворе.

В указанном интервале рН ПЭ стабильная, и выход ее составляет 56-67%.

При рН ниже 10,5 уровень ПГ активности не удовлетворяет требованиям, предъявляемым потребителем к ферментному препарату ПЭ, так как содержание ПГ значительно превышает значение 0,5%.

При рН выше 11,5 возрастает степень инактивации ПЭ в растворе по сравнению с рН 10,5-11,5, и таким образом уменьшается выход ПЭ в конечном препарате.

Выбор плотности тока от 0,05 до 30 м А/см² необходим для того, чтобы ПЭ в растворе сохранилась в активном состоянии. При этом не наблюдается изменения структуры белковой молекулы, процесс идет равномерно, и температура ферментного раствора не превышает 35^оС, т.е. лежит в зоне термостабильности ПЭ.

Снижение плотности тока менее 0,05 м А/см² ведет к замедлению или прекращению электролиза, и либо требуемое значение рН вообще не может быть достигнуто, либо достигается за счет значительного увеличения продолжительности процесса в несколько раз, что влечет за собой падение ПЭ активности в процессе обработки и становится экономически нецелесообразным.

Увеличение плотности тока свыше 30 м А/см² приводит к слишком быстрому изменению рН. В осадок помимо балластных белков выпадает ПЭ, снижается выход фермента. Кроме того, из-за высокой силы тока происходит перегрев ферментного раствора, что ведет к дополнительной инактивации ПЭ.

Для осуществления процесса электрохимической обработки ферментного раствора со смещением рН до 10,5-11,5 необходимо процесс вести так, чтобы электролиз проводился против раствора солей неорганических кислот в концентрации 0,3-2,0%. При концентрации солей ниже 0,3% процессы электролитического изменения рН ферментного раствора или резко замедляются, или не идут совсем. При увеличении концентрации солей выше 2,0% неоправданно увеличивается расход реагентов, и в атмосферу выделяется повышенное количество газов.

Раствор, содержащий комплекс пектолитических ферментов, из которого выделяют ПЭ, готовят экстракцией поверхностной культуры, содержащей пектолитические ферменты, или растворением готовых ферментных препаратов, полученных при поверхностном или глубинном культивиро- вании, или используют непосредственно культуральную жидкость, полученную после отделения биомассы.

Исходный ферментный раствор помещают в катодную камеру диафрагменного электролизера. В анодную камеру заливают раствор соли неорганической кислоты массовой концентрацией 0,3-2,0%, обеспечивающий смещение рН ферментного раствора в щелочную зону и протекание тока плотностью 0,05-30,00 мА/см². При электролитической обработке ферментного раствора рН ферментного раствора смещается в щелочную зону, и процесс электрообработки прекращают при достижении рН 10,5-11,5. Обработанный ферментный раствор выдерживают при температуре 4-35^о/С (оптимально 25-30^оС) в течение 0,5-4,0 ч (оптимально 1,5-2,5 ч), и сформировавшийся осадок удаляют центрифугированием или фильтрацией. Фильтрат, практически не содержащий ПГ, подкисляют соляной кислотой до рН 4,5-5,5 и ПЭ выделяют из раствора известным способом.

П р и м е р 1. В катодную камеру диафрагменного электролизера наливают водную вытяжку поверхностной культуры Asрergillus foetidus М-45, в анодную камеру наливают 0,3%-ный водный раствор NaCl и подводят постоянный электрический ток плотностью 1,5 мА/см². Через 4 мин рН ферментного раствора достигает 10,5, и процесс электролитической обработки прекращают, ферментный раствор сливают из камеры, выдерживают при 35^оС в течение 0,5 ч, образовавшийся осадок удаляют центрифугированием и в надосадочной жидкости рН доводят до 5,5 раствором НСl. После обработки содержание
ПЭ = 5,3 ед/мл,
ПГ = 620 ед/мл.

Выход ПЭ = 67,2%,
ПГ = 0,32%,
остаточная ПГ = 28%.

Величина остаточной ПГ характеризует изменение относительной вязкости 1% -ного пектинового раствора под действием возможных следов ПГ комплекса и должна варьироваться в препаратах ПЭ высокого качества в интервале от 0 до 40%.

П р и м е р 2. В катодную камеру диафрагменного электролизера заливают водную вытяжку поверхностной культуры А. foetidus М-45, а анодную камеру заливают 2,0% -ный водный раствор NaCl и подводят постоянный электрический ток плотностью 0,5 мА/см². Через 60 мин рН ферментного раствора достигает 11,5, и раствор сливают. Затем его выдерживают при 4^оС в течение 4 ч и отделяют сформировавшийся осадок фильтрацией, рН фильтрата устанавливают 4,5 с помощью раствора НСl. После обработки содержание
ПЭ = 4,6 ед/мл,
ПГ = 490 ед/мл.

Выход ПЭ = 57,1%,
ПГ = 0,06%,
остаточная ПГ = 10%
Полученный препарат высокого качества.

П р и м е р 3. Для электролитической обработки используют водную вытяжку поверхностной культуры А. foetidus и обрабатывают ее аналогично способу, описанному в примере 1, но в качестве анолита используют 1%-ный раствор NaCl. Процесс электролитической обработки проводят током плотностью 10,0 мА/cм² и прекращают его при достижении рН 11,0. Перед отделением осадка раствор выдерживают при 25^оС в течение 1,5 ч и рН раствора доводят с помощью НСl до рН 4,8.

После обработки содержание
ПЭ = 5,5 ед/мл,
ПГ = 480 ед/мл.

Выход ПЭ = 62,7%,
ПГ = 0,01%,
остаточная ПГ = 6%.

Полученный препарат высокого качества.

В табл. 1 представлены данные, где в качестве раствора комплексного пектолитического ферментного препарата используют раствор Пектофоетидина П10х, выделенный из поверхностной культуры гриба А.foetidus.

В табл. 2 представлены данные, где в качестве раствора комплексного ферментного препарата используют культуральную жидкость, полученную при глубинном культивировании А. Joetidus - продуцента пектолитических ферментов.

В табл.3 представлены данные, где в качестве комплексного пектолитического ферментного препарата используют раствор Пектофоетидина ГЗх.

Как видно из данных, описанных в примерах и приведенных в табл.1-3, предложенный способ получения ПЭ со следовыми количествами ПГ может быть использован для всех видов комплексных ферментных растворов.

Использование способа позволяет увеличить выход ПЭ до 56-67%, стабилизировать выход фермента из раствора комплексного пектолитического ферментного препарата и таким образом обеспечить более равномерный по составу конечный препарат; удешевить процесс за счет уменьшения расхода щелочи, использования экономически более дешевого и экологически более чистого процесса электролитической обработки, что в свою очередь ведет к уменьшению промышленных стоков и сокращению расходов на их очистку; использование ферментного препарата ПЭ в кондитерском производстве обеспечивает значительное снижение стоимости продукции; обработка высокометоксилированного цитрусового пектина, применяемого при получении мармеладов, ПЭ позволяет получить пектин, который желирует изделия до требуемой консистенции в присутствии меньшего количества сахара. Сокращение расхода последнего в мармеладах достигает 50%, и, соответственно, обеспечиваются значительная зкономия сахара, удешевление мармелада. Низкокалорийные, менее сладкие кондитерские изделия предназначены для широкого круга потребителей в соответствии с рекомендациями Института питания. Это является дополнительной профилактикой против ожирения; кроме того, само производство ПЭ по предлагаемому способу можно сделать замкнутым, безотходным, экологически чистым, если электроактивированный раствор соли, имеющий рН 1,1-1,5, использовать для обработки трудногидролизуемого сырья, которую обычно проводят при подготовке питательных сред для культивирования микроорганизмов на тех же микробиологических производствах.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству очищенного фермента пектинэстеразы (ПЭ), применяемого в кондитерской промышленности при производстве низкокалорийной продукции. Цель изобретения - повышение выхода ПЭ. Способ заключается в обработке раствора комплексного пектолитического ферментного препарата в катодном пространстве диафрагменного электролизера при плотности тока 0,05-30,00 мА/см² до достижения pH 10,5 - 11,5, выдерживании, отделении осадка, доведении pH до 4,5 - 5,5 и выделении целевого продукта. Причем против раствора комплексного пектолитического ферментного препарата используют водный раствор натриевой соли неорганической кислоты в концентрации 0,3 - 2,0%. Способ обеспечивает удаление щелочелабильных белков, в том числе полигалактуроназы (ПГ), при максимальном сохранении ПЭ в растворе. В указанном интервале pH ПЭ стабильна и выход ее составляет 56 - 67%. 3 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТИНЭСТЕРАЗЫ, предусматривающий обработку раствора комплексного пектолитического ферментного препарата до щелочного значения рН, выдерживание, отделение осадка, доведение рН раствора до 4,5 - 5,5 и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, обработку комплексного пектолитического ферментного препарата проводят в катодном пространстве диафрагменного электролизера при плотности тока 0,05 - 30,00 мА/см² против водного раствора натриевой соли неорганической кислоты в концентрации 0,3 - 2,0%.