СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК IN VIVO Российский патент 1998 года по МПК C12N5/00 C12N5/06 

Изобретение относится к области биотехнологии, а точнее к способам изменения степени стабильности кариотипа клеток.

В литературе описаны способы селекции перевивных клеточных линий in vivo и in vitro на повышение и на понижение степени стабильности кариотипа. В качестве критериев стабильности кариотипа, по которым проводили селекцию, использовались такие показатели, как "частота клеток с микроядрами" [1], "плоидность" [2] "частота сестринских хроматидных обменов" [3], "частота аберрантных метафаз" [4].

Целью изобретения является повышение эффективности способа. В качестве критерия, по которому проводится такая селекция на повышение или понижение степени стабильности кариотипа, используется показатель "частота клеток с мостами" (ЧКМс).

Сущность известного способа [5], взятого в качестве прототипа, заключается в следующем: путем внутривенной инъекции получают легочные экспериментальные метастазы уницеллюлярного происхождения (клоны) рабдомиосаркомы РА-23 крыс; в полученных клонах определяют частоту клеток с микроядрами (ЧКМ), отбирают клоны с минимальными ЧКМ (для отбора на повышение степени стабильности кариотипа) и с максимальными ЧКМ (для отбора на понижение степени стабильности кариотипа), получают из них суспензию для внутривенного введения с целью получения клонов-потомков. Сформировавшиеся клоны-потомки подвергаются выше описанной процедуре, т.е. определению в них ЧКМ, получению из них суспензии для проведения последующих шагов отбора и т.д. Таким образом, отбор идет по признаку "ЧКМ".

Известный способ-прототип применяется с целью получения клеточных популяций, контрастных по степени спонтанной стабильности кариотипа, для изучения механизмов возникновения спонтанных хромосомных и геномных аберраций, а также для изучения степени злокачественности клеток с различной степенью стабильности кариотипа.

В результате применения известного способа селекции по признаку "ЧКМ" в популяциях клеток рабдомиосаркомы крыс удалось установить положительную корреляцию между показателями "ЧКМ" и "частоты патологических митозов", а также отрицательную корреляцию между показателями "ЧКМ" и "метастатический потенциал".

Целью изобретения является повышение эффективности способа. Из литературы неизвестно о проведении селекции на повышение или понижение стабильности кариотипа по частоте клеток с мостами, что свидетельствует о новизне заявляемого способа. Известно, что возникновение дицентрических хромосом в результате структурных хромосомных аберраций, как правило, приводит к образованию мостов, которые могут сохраняться в интерфазе. В последующем, после образования мостов возникают циклы "разрыв-слияние-мост" [6 и 7] и эти циклы приводят к резкому нарастанию всех типов хромосомных и геномных мутаций в популяциях клеток [8].

Авторами экспериментально доказано, что селекция по повышенной частоте клеток с мостами ведет к снижению стабильности кариотипа. Селекция по низкой частоте клеток с мостами ведет к повышению стабильности кариотипа. Это положение указывает на соответствие заявляемого решения критерию "изобретательский уровень".

Поэтому показатель "ЧКМс" является признаком, по которому можно проводить эффективную селекцию, направленную как на понижение, так и на повышение степени стабильности кариотипа.

Сущность заявленного способа заключается в том, что беспородным белым крысам инъецируют внутривенно суспензию клеток рабдомиосаркомы, получают клоны в легких, анализируют их по признаку "ЧКМс" и получают из них суспензию для очередного цикла отбора.

После селекции на снижение частоты возникновения клеток с мостами в результате 5 циклов отбора получают популяцию клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс с показателями кариотипической гетерогенности достоверно меньшим, чем в популяции тех же клеток до отбора. И наоборот, после селекции на повышение частоты возникновения клеток с мостами в результате 5 циклов отбора получают популяцию клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс с показателями кариотипической гетерогенности достоверно большими, чем в популяции тех же клеток до отбора. В качестве показателей кариотипической гетерогенности (нестабильности) были изучены распределения по числу хромосом и содержание ДНК, оцениваемое методом проточной цитометрии.

Отличительными признаками заявленного решения являются следующие признаки.

1. В качестве признака, по которому проводится искусственный отбор, является показатель "частота клеток с мостами"
2. Селекция по признаку "частота клеток с мостами" оказалась эффективнее, чем селекция по признаку "частота клеток с микроядрами".

В результате отбора клонов РА-23 по признаку "частота клеток с микроядрами" (ЧКМ) средняя ЧКМ повысилась с 3,3% до 6,9% (в 2,1 раза при селекции на снижение стабильности кариотипа) и понизилась с 3,3% до 1,6% (в 2,1 раза при селекции на повышение стабильности кариотипа). В результате отбора клонов РА-23 по признаку "ЧКМс" средняя ЧКМс повысилась с 0,6% до 8,1 % (в 13,5 раз) и понизилась с 0,8% до 0,3% (в 2,7 раза).

Предлагаемый способ может применяться в научно-исследовательских целях и на предприятиях биотехнологической и медицинской промышленности (для селекции гибридом и миелом).

Пример 1. Отбора клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс, направленный на понижение частоты клеток с мостами, проводили по следующей схеме. Вычлененные из легких декапитированной крысы 53 клона отдельно помещают в лунки иммунологического планшета (ТУ-62-2-279-79) со средой ТС-199.

Клоны достают из лунки, расчленяют надвое. Из одной половины методом отпечатков делают мазки на предметном стекле, пронумерованном соответственно номеру лунки.

Оставшуюся часть клонов помещают обратно в лунки, планшет закрывают и помещают в холодильник при 4^oC на 8 - 12 ч. Приготовленные мазки фиксируют 96%-ным этиловым спиртом в течение 5 мин, высушивают, окрашивают флуорохромом Хехст-33258. Затем проводят анализ частоты мостов под иммерсией (окуляр 10х, объектив 100х). В каждом мазке анализируют по 500 клеток. Частоту клеток с мостами выражают в процентах. Средняя частота клеток с мостами в исходной выборке из 53 клонов составила 0,8%, размах изменчивости от 0,0% до 3,0% (фиг. 1, а). Из исходной популяции отбирают 1 клон с минимальным показателем частоты мостов, имеющий 0,0% клеток с мостами.

Из него готовят суспензию для в/в инъецирования, для чего помещают в стерильный флакон, гомогенизируют с помощью ножниц, заливают 5 мл универсальной среды TC-199 и пипетируют шприцем в течение 2 мин.

Полученную суспензию фильтруют через 4 слоя стерильной марли в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 10 мин при 100 об/мин. Надосадок сливают. К полученному осадку клеток добавляют 3 мл среды ТС-199, определяют концентрацию клеток с помощью камеры Горяева и доводят концентрацию до 60000 клеток/мл. Подготовленную таким способом суспензию клеток рабдомиосаркомы инъецируют внутривенно белым беспородным крысам в объеме 0,2 мл на особь. Через 25 сут появляются признаки опухолевого поражения животного (прогрессирующее удушье, синюшность кожных покровов). Вскрывают полость легких, отпрепаровывают сформировавшиеся опухолевые клоны, помещают их в лунки иммунологического планшета со средой ТС-199, делают мазки, проводят оценку по частоте клеток с мостами, анализируя по 500 клеток каждого из исследуемых в данном цикле клона, определяют ЧКМс. В результате проведения отбора на понижение средняя частота клеток с мостами после 1-го цикла отбора составила 0,6% (фиг. 1, б). Отбирают один клон с минимальным показателем ЧКМс, имеющий 0,0% клеток с мостами, и используют его для очередной внутривенной прививки во 2-й цикл отбора. Таким образом, описанные выше манипуляции повторяются в каждом цикле отбора.

В результате двух циклов отбора средняя частота клеток с мостами понизилась до 0,5% (фиг. 1, в). Один из 47 исследованных клонов с минимальным показателем ЧКМс 0,0% был отобран для очередного 3-го цикла отбора.

В результате 3-го цикла отбора методом, описанным выше, средняя частота клеток с мостами в популяции 43 клонов составила 0,6% (фиг. 2, г). В очередной четвертый цикл отбора был взят клон, имеющий 0,0% клеток с мостами.

В результате 4-го цикла отбора средняя частота клеток с мостами в выборке из 51 клона составила 0,5% (фиг. 3, д). Пятый цикл отбора оказался наиболее эффективным: средняя частота клеток с мостами в выборке из 46 клонов составила 0,3%, при этом более 60 клонов имели частоту мостов, не превышающую 0,2% (фиг. 3, е).

Таким образом, проведены 5 циклов селекции популяции клеток рабдомиосаркомы на снижение частоты клеток с мостами и степени кариотипической изменчивости. Частота встречаемости клеток с мостами в полученных путем заявляемого способа селекции популяциях клеток рабдомиосаркомы снизилась с 0,6% до 0,3%, т. е. в 2,7 раза (при P < 0,001 по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни).

Пример 2. Отбор опухолевых клонов, направленный на повышение частоты клеток с мостами, проводили по следующей схеме. Вычлененные из полости легких декапитированной крысы 48 опухолевых клона отдельно помещают в лунки иммунологического планшета (ТУ 64-2-279-79) со средой ТС-199.

Клоны достают из лунки, расчленяют надвое. Из одной половины методом отпечатков делают мазки на предметном стекле, пронумерованном соответственно номеру лунки.

Оставшуюся часть клонов помещают обратно в лунки, планшет закрывают и помещают в холодильник при 4^oC на 8 - 12 ч. Приготовленные мазки фиксируют 96%-ным этиловым спиртом в течение 5 мин, высушивают, окрашивают флуорохромом Хехст-33258. Затем проводят анализ частоты мостов под иммерсией (окуляр 10х, объектив 100х). В каждом мазке анализируют по 500 клеток. Частоту клеток с мостами выражают в процентах. Средняя ЧКМс в исходной выборке из 48 клонов составила 0,6%, а размах изменчивости от 0,0% до 2,2% (фиг. 4, а). В 1-й цикл отбора взяли три клона с ЧКМс от 1,0% до 1,2%. Из них готовят суспензию для в/в инъецирования, для чего их помещают в стерильные флаконы, гомогенизируют с помощью ножниц, заливают 5 мл универсальной среды ТС-199 и пипетируют шприцем в течение 2 мин.

Полученную суспензию фильтруют через 4 слоя стерильной марли в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин. Надосадок сливают. К полученному осадку клеток добавляют 3 мл среды ТС-199, определяют концентрацию клеток с помощью камеры Горяева и доводят концентрацию до 60000 клеток/мл. Подготовленную таким образом суспензию клеток рабдомиосаркомы инъецируют внутривенно белым беспородным крысам в объеме 0,2 мл/особь.

Через 24 - 28 сут появляются признаки ухудшения состояния животного. Вскрывают полость легких, отпрепаровывают сформировавшиеся опухолевые клоны, помещают их в лунки иммунологического планшета со средой ТС-199, делают мазки, проводят оценку по признаку "ЧКМс", анализируя по 500 клеток каждого из 50 исследуемых в этом цикле опухолевых клона, определяют частоту клеток с мостами. В результате проведения 1-го цикла отбора средняя ЧКМс составила 0,8%, а размах изменчивости от 0,0% до 3,0%, (фиг. 4, б). Три клона с ЧКМс 2,0%, 2,6% и 3,0% были взяты во 2-ой цикл отбора. Таким образом, описанные выше манипуляции повторяются при проведении каждого последующего цикла отбора.

Во 2-ом цикле отбора в выборке из 52 клонов средняя ЧКМс составила 1,7%, а размах изменчивости увеличился от 0,0% до 5,8%, (фиг. 4, в). В очередной 3-й цикл отбора были взяты два клона с ЧКМс 4,4% и 5,8%.

В результате 3-го цикла отбора в выборке из 48 клонов средняя ЧКМс составила 1,6%, а размах изменчивости от 0,2% до 5,2% (фиг. 5, г). В четвертый цикл отбора был взят клон, имеющий 5,2% клеток с мостами.

Четвертый цикл отбора при исследовании выборки из 47 клонов показал, что средняя ЧКМс повысилась до 4,3% (фиг. 5, д). Для проведения 5-го цикла отбора были взяты клоны с ЧКМс 9,0% и 14,4%.

Пятый цикл отбора оказался наиболее эффективным: средняя ЧКМс составила 8,1%, из полученных 15 клонов не было встречено ни одного клона, который бы имел частоту мостов менее 3,2% (фиг. 5, е).

Таким образом, отбор на повышение ЧКМс был эффективным. Частота встречаемости клеток с мостами в полученных путем заявляемого способа селекции популяциях клеток рабдомиосаркомы повысилась с 0,8% до 8,1%, т.е. в 13,5 раз (при P < 0,001 по непараметрическому критерию Вилкоксона-Мана-Уитни).

После проведения 5 циклов селекции на снижение встречаемости клеток с мостами (пример 1), было исследовано число хромосом данной линии. Для получения препаратов метафазных хромосом приготовленную из опухолевых клонов клеточную суспензию инкубировали с колхицином в конечной концентрации 0,7 мкг/мл, клетки подвергали гипотонии 0,55% раствором KCL и фиксировали метанол-уксусным фиксатором. Для подсчета хромосом отбирали окрашение по Гимза метафазные пластинки округлой формы, сохранившие ореол цитоплазмы, фотографировали каждую пластинку и по снимкам определяли число хромосом (ок. 10х, об. 100х).

Проведенный анализ показал, что метафазы с 56 хромосомами встречаются наиболее часто и составляют до 40% из всех 127 исследованных метафаз, а метафазы, в которых встретилось более 60 хромосом, составляют менее 5% из всей проанализированной выборки.

Причем во всех 123 исследованных метафазах не было обнаружено дицентрических хромосом (фиг. 6, а).

Важно отметить, что число хромосом в клетках рабдомиосаркомы РА-23 крыс исследовали ранее (Каминская и др. 1989) до проведения отбора по частоте клеток с мостами. Было установлено, что модальный класс находился в области 60-70 хромосом (фиг. 6, б).

В популяции клеток РА-23, селектировавшейся на повышение частоты клеток с мостами, определить число хромосом не удалось, так как эта популяция отличалась высокой плоидностью.

Изучение гетерогенности клеточной популяции опухолевых клонов по содержанию ДНК проводили методом проточной цитометрии. Исследованию были подвергнуты 1 исходный клон с ЧКМс 1,8%, 1 клон, отселектированный на повышенную частоту мостов, с ЧКМс 6,8% и смесь из 5-ти клонов, отселектированных на пониженную частоту мостов со средней ЧКМс 0,3%.

Из опухолевого материала механическим способом приготавливалась одноклеточная суспензия с концентрацией 1 млн клеток в 1 мл раствора Версена (ЭДТА), которая окрашивалась следующим образом: к 1 мл суспензии добавляли 0,1 мл 1%-го водного раствора тритона Х-100 (Flura, Швейцария), 0,02 мл раствора этидиума бромида (Aldrich-Ghemie, США) в концентрации 1 мг/мл, 0,004 мл оливомицина (Объединение "Мосмедпрепараты" им. Л.Я. Карпова, СССР) в той же концентрации и 0,05 мл 0,3 М раствора MgCl (Barlogie, B., 1976, Розанов Ю.М., 1988). Окраску проводили в течение 2 ч при температуре от 0 до 5^oC.

Исследование осуществлялось на проточном цитофлюориметре МД-116 (ГОИ им. С. И. Вавилова, Санкт-Петербург) со 128 канальным анализатором и ртутно-кварцевой лампой ДРШ-250-2 в качестве источника света. Проточный цитофлюориметр оснащен персональным компьютером IBM AT-486 с пакетом прикладных программ для изучения материала.

Проточная цитометрия ДНК показала, что клоны, селектируемые на повышенную и пониженную частоту клеток с мостами, различаются по профилю ДНК как между собой, так и от исходной популяции (фиг. 7). Так, в обеих вновь полученных популяциях присутствовал клон клеток с индексом ДНК 1,7, (т.е. количество ДНК в ядрах клеток этого клона было в 1,7 раза больше, чем в ядрах диплоидных клеток) отсутствовавший в исходной популяции. При этом популяции после 5-ти циклов отбора как на понижение, так и на повышение заметно различались между собой по количеству клеток данного клона (в первом случае присутствовало приблизительно 20% анеуплоидных клеток, а во втором - 7%). Кроме того, присутствовавший в небольшом количестве в исходной популяции клон гексаплоидных клеток (около 4%), не выявлялся на ДНК-цитограмме опухолевого клона, полученного в результате 5-ти циклов отбора на снижение степени кариотипической изменчивости, в отличие от ДНК-цитограммы клона с высокой частотой клеток с мостами, где количество гексаплоидных клеток возрастало до 20%.

Использованная литература
1. Кравцов В. Ю. , Яковлев А.Ф., Федорова Е.В., Вахтин Ю.Б. Отбор на снижение и повышение спонтанной нестабильности кариотипа в клеточных популяциях перевивной миеломы SP 2/0 мышей // ДАН СССР, т. 320, N 4, 1991, с. 1000 - 1003.

1. Савченко В. К., Михайлович Л.С., Кукушкина Л.М. Ассоциативный отбор клонов клеток китайского хомячка по комплексу количественных признаков. // Биополимеры и клетка. т. 2, 1986. с. 200 - 206.

3. Tsuji H., Takahashi E-I., Tsuji S., Tobari I., Shiomi T., Hama-Inaba H. , Sato K. Five different genes participate in the formation of baseline sister-chromatid exchanges and spontaneous chromosomal aberrations // Mutat. Res. 1987. Vol. 178. P. 99-106.

4. Emst T. , Jackson C., Bames D. Karyotypic stability of serum-free mouse embryo cells. // Cytotechlogy. 1991. N 5. P. 211 - 222.

5. Кравцов В.Ю., Федорова Е.В., Каминская Е.В., Гужова И.В., Яковлев А. Ф. , Вахтин Ю.Б. Межклональные и межпопуляционные различия по частоте спонтанных кариотипических изменений в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы PA-2 крыс. // Вопросы онкологии. т. 38, N 10, т. 38, 1992. С. 1228 - 1235.

6. Прокофьева-Бельговская А.А. Радиационные поражения хромосом на ранних стадиях развития лосося. // Цитология. т. 3, N 4. с. 437 - 445.

7. McClintock B. The production of homozygous deficient tissues with mutant characteristics be means of the aberrant mitotis behavior of ring-shaped chromosomes. // Genetics. 1938. Vol. 23. N 4. P. 315 - 376.

8. Казанцева И. А. Патология митоза в опухолях человека. Новосибирск, Наука, 1981, с. 144.

Использование: в биотехнологии. Сущность изобретения: селекцию популяции клеток in vivo проводят путем повторения циклов отбора клеток по критерию степени нестабильности кариотипа, в качестве которого используют показатель частоты клеток с мостами. Отбор клонов с минимальным показателем приводит к получению популяции клеток с пониженной степенью кариотипической нестабильности, а отбор клеток с максимальным показателем приводит к получению популяции клеток с повышенной степенью кариотипической нестабильности. 7 ил.

Способ селекции популяции клеток in vivo, включающий инъекцию клеток рабдомиосаркомы, выделение опухолевых клонов, отбор клеток по критерию степени нестабильности кариотипа, вторичную инъекцию отобранных клеток, повторение циклов отбора, отличающийся тем, что в качестве критерия степени нестабильности кариотипа используют показатель частоты клеток с мостами, при этом при отборе клонов с минимальным показателем получают популяцию клеток с пониженной степенью кариотипической нестабильности, а при отборе клеток с максимальным показателем получают популяцию клеток с повышенной степенью кариотипической нестабильности.