Способ селекции популяции клеток IN VIVo Советский патент 1993 года по МПК C12N15/00 C12N5/00 

СО

С

Использование: биотехнология, способы изменения наследственных признаков клеточных линий путем отбора опухолевых узлов по показателям микроядерного теста. Сущность изобретения: отбирают внутри- брюшинные опухолевые узлы с минимальными показателями микроядерного теста, полученные популяции клеток сёлекциони- руют. 1 ил..

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к способам изменения наследственных признаков клеточных линий.

Целью изобретения является снижение кариотипической нестабильности популяций клеток миелом.

Сущность известного способа, взятого в качестве прототипа, заключается в следующем: путем внутривенной инъекции получают легочные экспериментальные метастазы уницеллюлярного происхождения рабдоми- осаркомы крыс; полученные метастазы анализируют микроядерным тестом (МЯТ), отбирают один экспериментальный метастаз с максимальной частотой клеток с микроядрами, получают из него суспензию для внутривенного введения с целью реклонирования. Выросшие экспериментальные метастазы-потомки подвергаются выше описанной процедуре, т.е. оценке МЯТ, отбору одного клона с максимальным показателем МЯТ, получению из него суспензии для последующего внутривенного введения с целью реклонирования. Таким образом, отбор идет по одному экспериментальному метастазу на фоне реклонирования.

Известный способ-прототип применяется с целью изучения корреляции между степенью нестабильности кариотипа злокачественности популяций опухолевых клеток. . .

В результате применения известного способа селекции на повышение частоты спонтанного образования микроядер в клонах экспериментальных легочных метастазов перевивной рабдомиосаркомы крыс удалось получить популяцию клеток с достаточно большей частотой клеток с микроядрами и достоверно меньшим метастатическим потенциалом (степенью злокачественности). Установлена отрицательная зависимость между степенью нестабильности кариотипа

00

о

Os

Ю

(Л

СО

и степенью злокачественности в популяциях опухолевых клеток.

Известно что в ходе опухолевой прогрессии степень нестабильности кариотипа клеток возрастает, а также сохраняется на высоком уровне при пассировании опухолевых клеток линий In vivo и In vitro.

В литературе не известны работы по проведению искусственного отбора, на- правлёйнЬгр на снижение частоты спонтан- ных нарушений кариотипов в популяциях перевивных клеточных линий.

Целью изобретения является степени кариотипической нестабильности популяций перевивных клеточных линий миелом мышей, т.е. получение популяций клеток миелом с относительно стабильным кариотипом и, следовательно, со стабильным фенотипом, используемых в дальнейшем для получения гибридов-продуцентов.

Известно, что при использовании в гиб- ридомной технологии миелом, не, тестированный на стабильность кариотипа, наблюдается высокая степень кариотипической нестабильности и низкая эффективность секреции гибридом. Вследствие нестабильности, несбалансированности кариотипа, элиминация хромосом с желаемыми генами может проходить с высокой частотой.

Одной из причин кариотипической не- стабильности гибридов-продуцентов является изначальная кариотипическая нестабильность клеток перевивных линий, взятых в качестве партнеров для гибридизации.

В связи с этим существует необходимость получения клеточных популяций миелом с пониженной частотой спонтанной кариотипической изменчивости.

По причине наследственной гетероген- ности в популяциях клеток перевивных линий по признаку спонтанная частота клеток с МЯТ авторы предлагают проводить искусственный отбор, направленный на снижение спонтанной частоты клеток, с микроядрами. В ходе отбора установлено достоверное снижение частоты спонтанного образования микроядер в клетках, что является показателем снижения степени кариотипической изменчивости в популяциях клеток миелом.

Сущность заявленного способа заключается в том, что мышам линии BALB/c инъецируют внутрибрюшинную суспензию клеток миеломы, получают внутрибрюшин- ные (в/б) опухолевые узлы, анализируют их методом МЯТ, отбирают в/б узлы с минимальными показателями МЯТ, получают из них суспензию для очередного цикла отбора.

В качестве опухоленосителей при селекции заявленным способом могут использоваться МЫШИ ДруГИХ ЛИНИЙ;

Критерием способа является спонтанная частота возникновения клеток с микроядрами. Но при селекции по высокой спонтанной частоте возникновения клеток с микроядрами (в способе-прототипе) - повышается степень злокачественности клеток и степень кариотипической нестабильности..

При селекции на снижение частоты возникновения клеток с микроядрами (заявленным способом) в результате 4-х циклов отбора получают популяции клеток миеломы о достоверно высокой стабильностью кариотипа (до 0,60% изменчивости кариотипа), т.е. получают клетки иного качества, обладающие стабильными фенотипическими свойствами, представляющие большой интерес для гибридомной технологии.

Отличительными признаками заявленного решения являются следующие признаки:. -

внутрибрюшинная инъекция мышей линии BALB/ с суспензией клеток миеломы. Линия BALB/c является сингенной линией для получения конкретной миеломы SP 2/0, которая используется для получения гибридом;

оценка и отбор внутрибрюшинных опухолевых узлов с минимальными показателями микроядерного теста для последующего реклонирования;

получение суспензии из отобранных узлов для очередного цикла отбора.

Существенным признаком является отбор внутрибрюшинных узлов с минимальными показателями микроядерного теста. В результате 4-х циклов отбора по этому критерию получают потомство популяции клеток миеломы, имеющее достоверно низкую частоту клеток с микроядрами (до 0,60% в среднем по популяции). В исходной же популяции средняя частота клеток с микроядрами составляет 2,1% (с изменчивостью от 0,6 до 5,3%).

Преимуществом отбора внутрибрюшинных узлов перед легочными метастазами заключается в следующем: в их высокой скорости формирования (7-14 суток) и достаточном количестве для проведения популя- ционного теста и отбора.

Легочные метастазы формируются в течение 30 дней и более, и количество их значительно и недостаточно для проведения селекции.

Кроме того, при отборе внутрибрюшинных узлов после нескольких циклов отбора получают популяции клеток миеломы с достоверно стабильным кариотипом и, следовательно, стабильными фенотипическими признаками, обеспечивающими высокую жизнеспособность клеток, и при использовании их для получения гибридом-стабильную секрецию антител.

Таким образом, в результате селекции по признаку низкой спонтанной частоты возникновения клеток с микроядрами в каждом последующем поколении популяции клеток миеяомы. происходит снижение степени спонтанной частоты возникновения клеток с микроядрами, т.е. снижение степени кариотипической нестабильности и степени злокачественности клеток. Селекция клеток заявленным способом позволяет снизить частоту встречаемости клеток с микроядрами в 3 и более раз, что свидетельствует о повышении жизнеспособности клеток и о высокой стабильности их кариотипа, что является целью изобретения.

Известным же способом изучается и определяется степень злокачественности и связь ее с нестабильностью кариотипа в получаемых популяциях клеток, не представляющих интереса для гибридомной биотехнологии из-за их нестабильных фенотипичес ких свойств, обусловленных нестабильностью кариотипа.

В способе-прототипе проводится отбор одного метастаза с максимальной частотой клеток с микроядрами и в результате нескольких циклов отбора установлено возрастание степени нестабильности кариотипа и степени злокачественности клеток, т.е. обеспечивается получение популяции клеток с высокой спонтанной частотой возникновения микроядер.

Использование отселектированных заявляемым способом на стабильность кариотипа клеток миелом при получении гибридом повысит уровень селекции гибридом, что даст в. итоге экономию в народном хозяйстве.

Предлагаемый способ может применяться на предприятиях биотехнологической, медицинской промышленности и в научно-исследовательских целях,

На чертеже Показана частота клеток с микроядрами (ЧКМ) во внутрибрюшинных узлах перевивной миеломы SP 2/0.

По оси абсцисс - частота клеток с микроядрами (ЧКМ), %. По оси ординат - число внутрибрюшинных узлов, %, а - 40 в/б узлов до отбора; б - 20 в/б узлов после 1-го цикла отбора: в - 26 в/б узлов после 2-го цикла отбора; г - 33 в/б узла после 3 цикла отбора; д - 25 в/б узлов после 4 цикла отбора, направленного на снижение спонтанной ЧКМ в в/б узлах.

Пример. Отбор в/б узлов миеломы SP 2/0 проводили по Следующей схеме. Вычлененные из брюшной полости декапити- рованной мыши 40 в/б узлов (в/б узлы

5 фиксированы на кишечнике и брызжейке)

отдельно помещают в лунки иммунологического планшета 64-2-279-79) со средой

Узелки достают из лунки и методом от10 печатков делают мазки на стерильном предметном стекле (около 1000 клеток на 1 предметное стекло), пронумерованном соответственно номеру лунки.

Оставшуюся часть в/б узлов помещают

15 обратно в лунку, планшет закрывают и помещают в холодильник при +4°С на 8-12 ч. Приготовленные мазки фиксируют 96% этиловым спиртом с течение 5 мин, высушивают, окрашивают азур-эозином (в соот20 ношении 1 часть 0,1% эозина на 3 части 0,1 % азура, разбавленного в 50 раз дистиллированной водой) в течение 10 мин.

Затем проводят микроядерный тест под иммерсией (окуляр 10, объектив 100). В каж25 дом мазке методом МЯТ анализируют по 300 клеток. Частоту клеток с микроядрами выражают в процентах. Средняя частота клеток с микроядрами (ЧМК) в исходной выборке из 40 в/б узлов составила 2,1 %, раз30 мах изменчивости от 0,6% до 5,3 % (чертеж). Из исходной популяции отбирают узлы с минимальными показателями МЯТ, имеющие от 0,6 до 1,0% клеток с микроядрами. Из «их готовят суспензию для в/б инъеци35 рования, для чего их помещают в стерильные флаконы (бак-печатки), гомогенизируют с помощью ножниц, заливают 5 мл универсальной среды ТС-199 и пипетирукп шприцем в течение 3 мин. .

40Полученную суспензию фильтруют через 4 слоя стерильной марли в центрифуж- ную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадок сливают. К полученному осадку клеток добавляют 3

45 мл среды ТС-199. определяют концентрацию клеток с помощью камеры Горячева и доводят концентрацию до 3 млн. клеток/мл. Подготовленную таким образом суспензию клеток миеломы инъецируют внутрибрю50 шинно мышам линии BALB/c в дозе 1 мл/особь.

Через 12 суток появляются признаки внутрибрюшинного асцитного роста (видимое увеличение области живота животного).

55 Вскрывают брюшную полость, отпрепаро- вывают сформировавшиеся опухолевые узлы, помещают их в лунки иммунологиче- ского планшета со средой ТС-199, делают мазки, проводят оценку методом МЯТ, анализируя по 300 клеток каждого из 20 исследуемых в этом цикле в/б узлов, определяют частоту клеток с микроядрами. Средняя частота клеток с микроядрами в результате 1-го цикла отбора составила 1,1% (чертеж). Отбирают 5 узлов с минимальными показа- телями МЯТ, имеющих от 0,3-0,6% клеток с микроядрами и используют их для очередных в/б прививок во 2-ой цикл отбора. Таким образом, описанные выше манипуляции повторяются на каждом цикле отбора.

В результате двух циклов отбора средняя частота клеток с микроядрами понизилась до 0,89%, а размах изменчивости сузился (min - 0%, max - 3%) (чертеж). Пять из 26 исследованных в/б узлов с минималь- ными показателями МЯТ (от 0 до 0,3 %) были отобраны для 3-го цикла отбора.

В результате 3 цикла отбора, проведенного методом, описанным выше, средняя частота клеток с микроядрами в популяции 33 в/б узлов составила 0,75% (чертеж). В очередной, четвертый цикл отбора были взяты в/б узлы, имеющие 0% клеток с микроядрами.

Четвертый цикл отбора также оказался эффективным: средняя частота клеток с

микроядрами в выборке из 25 в/б узлов составила всего 0,60%, 56% в/б узлов имели показатели микроядерного теста не более 1 % (чертеж).

Таким образом проведены 4 цикла искусственной селекции популяций клеток ми- елом на снижение степени частоты клеток с микроядрами (кариотипической изменчивости). Частота встречаемости клеток с микроядрами в полученных путем заявляемого способа селекции популяциях клеток мие- лом снизилась с 2,1 до 0,60%, т.е. в 3 с лишним раза (при Р 0,001 по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна- Уитин).

Формула изобретения Способ селекции популяции клеток in vivo, включающий экспресс-анализ частоты микроядер в опухолевых узлах, отбор опухолевых узлов с их дальнейшей перевивкой, отличающийся тем, что, с целью снижения степени кариотипической нестабильности популяции клеток миелом, отбирают внутрибрюшинные опухолевые узлы с минимальными показателями микроядерного теста.

a

--I

± 2 s-tr/f r

j

jro3Dtt

К

fp p

УР 20 SO

e / 2 t

%

S.

k

°

2e /f

/ 2 У

0 S 2 $

j

.

)

)

MJfty