Штамм клеток рабдомиосаркомы крыс РА-22, используемый для выявления особенностей опухолей, устойчивых к лечению гипертермией Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в экспериментальной онкологии для изучения процессов метастазирования терморезистентныхЪпу- холей, а также для скрининга химиотерапев- тических препаратов, подавляющих рост и метастазирование опухолей человека, устойчивых к термотерапии.

Известны штаммы опухолевых клеток мышей, характеризующиеся высокой степенью злокачественности и органотропным метастазированием: меланома В16 и ее субштаммы, КСМЛ (штамм карциономы, мета- стазирующей в легкие), BMP (штамм высокометастазирующего рака) и его субштаммы, ЛМТ (лимфогенно метастазирую- щая тератокарционома). Однако частота метастазирования этих штаммов и opTa flfo - тропность метастазирования низки, частота метастазирования в другие органы более 15%, не известен штамм клеток, полученный на основе опухоли скелетных мышц

(рабдомиосаркомы), штаммы получены не в результате длительней селекции, а лишь после 10-15 циклов отбора, характеризуются низкой колониеобразующей способностью и не обладают устойчивостью к термальным воздействиям.

Наиболее близким к изобретению является штамм рабдомиосаркомы РА-2 крыс, полученной в Институте цитологии АН СССР путем многоступенчатого отбора на аффинитет к легочной ткани. Штамм характеризуется высоким метастатическим потенциалом, более высокой по сравнению с аналогами, колониеобразующей способностью (КОЕ 0,013 ±0,006) w аффинитетом к легочной ткани (метастазы в другие органы не обнаружены), околотетраплоидным содержанием ДНК (ДИ 1,97-2,04).

Однако клетки штамма РА-2 чувствительны к термальному воздействию 43, 44 и 45°С (До 1,6 Гр) и недостаточно высокой колониеобразующей способностью.

Целью изобретения является получение штамма рабдомиосаркомы крыс с наследственно повышенной термоустойчивостью клеток.

Данный штамм РА-22 получен в процессе многоступенчатой селекции (78 циклов отбора) на устойчивость к термальным воздействиям на основе штамма клеток рабдомиосаркомы РА-21, который получен в процессе селекции (200 циклов отбора) штамма РА-2.

Селекцию штамма РА-22 проводили в условиях In vtvo при помощи внутривенных перевивок суспензий одиночных опухолевых клеток, подвергавшихся термальному воздействию ин витро, белым беспородным крысам через каждые 20 дней. Суспензии одиночных опухолевых клеток получали из опухолевой ткани, взятой от 20-30 легочных метастазов, с использованием ростовой среды Игла. Нагревание суспензии проводили на водяной бане в термостате (точность нагрева ±0,1°С), после нагрева клетки выдерживали 1 ч при комнатной температуре и вводили внутривенно животным, Доза вводимых опухолевых клеток - 200000 клеток на одно животное. Штамм хранится в Банке перевивных штаммов ВОНЦ АМН СССР, регистрационный N; 13-9-3.

Особенности культивирования штамма в условиях In vitro.

Штамм культивировали на ростовой среде Игла с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, 2 мМ глутамина, 200 ед/мл пенициллина и 0,0004 г/мл стрептомицина. Культивирование проводили при 37иС в герметических флаконах в термостате без подачи С02. Кратность рассева 1:3 при пересеве через 72 ч. Посевная доза клеток - 200000 на мл. Криоконсервацию проводили в сыворотке эмбрионов коровы с добавлением 10% диметилсульфоксида при концентрации 1x106 клеток/мл, Жизнеспособность клеток после размораживания 85- 90%.

Ростовые характеристики штамма.

Прививаемость животным при внутривенных инъекциях 10000 клеток/жйеотмое 100%, при подкожном введении суспензии опухолевых клеток в дозе 50000 клеток/животное 100%, аффинитет к легочной ткани (экспериментальные метастазы формируются только в легких) 100%, колониеобразу- ющая способность (КОЕ) 0,1б±0,008.

Морфологические характеристики штамма.

Штамм представляет собой низкодифференцированную веретеноклеточную раб- домиосаркому. Основные клеточные

элементы веретеновидные (12-25 мкм) и округлые 9-15 мкм клетки4. Штамм характеризуется околотетраплоидным содержанием ДНК (диплоидный индекс 1,86-1,91). Кариологически штамм характеризуется 21 парой хромосом, большое число мета- и субмета- центриков.

Особенностью штамма является высокая термоустойчивость клеток, Значения Д0,

0 вычисленные по кривым выживаемости клеток после нагрева, равны при термальной обработке 43°С 9,8 мин, при термальной обработке 44°С 12,5 мин, при термальной обработке 45°С 13,5 мин.

5 Особенностью штамма также является высокая радиоустойчивость клеток. Значение До, определенное по кривой выживаемости клеток после, их облучения в диапазоне доз 1-10 Гр, равно 2,4 Гр.

0 П р и м е р 1. Для изучения динамики утраты термоустойчивыми опухолевыми клетками способности метастазировать после их нагревания при 45°С в течение 10, 20 и 30 мин суспензию одиночных опухолевых

5 клеток (концентрация клеток 1 млн/мл) в среде Игла помещали на водяную баню в термостат (томность нагрева ±0,1°С) при 45°С на 10, 20 и 30 мин, после нагрева клетки выдерживали 1 ч при комнатной темпе0 рэтуре и вводили внутривенно каждую пробу 10 белым беспородным крысам (доза введения - 200000 клеток на животное) Через 21 день животных забивали и проводили подсчет экспериментальных метаста5 зое в легочной ткани. На основании полученных результатов строили кривые выживаемости клеток (фиг, 1).

Полученная кривая доза-эффект показывает, что в пределах термальных воздей0 ствий 1-5 мин подвергнутые нагреванию опухолевые клетки репарируют термальные повреждения. Эффективное подавление способности опухолевых клеток к метаста- зированию начинается с 5 мин термального

5 воздействия. Нарастание утраты способности формировать экспериментальные метастазы характеризуется в данном примере значением Д0 (До 13,5 мин). Таким образом, штамм позволяет выявить динамику ут0 раты термоустойчивыми опухолевыми клетками способности формировать экспериментальные метастазы при определенном режиме нагревания и прогнозировать

5 результаты термального воздействия различной продолжительности.

П р и м е р 2. Для изучения комбинированного действия нагревания и различных режимов облучения на термоустойчивые опухолевые клетки суспензию одиночных опухолевых клеток РА-22 (концентрация

клеток - 1 млн/мл) в среде Игла помещали на водяную баню в термостат, точность нагрева 0,1°С (при 44°С на 20 мин), после нагрева клетки выдерживали 5-10 мин при комнатной температуре и облучали в диапазоне доз 1-10 Гр на рентгеновском аппарате РУФ-1, фильтр 1,0 Си, 257 р/мин, вводили внутривенно каждую пробу 10 белым беспородным крысам (доза введения 10000-400000 клеток на крысу). Через 21 день животных забивали и проводили подсчет экспериментальных метастазов в легочной ткани. На основании полученных результатов строили кривую выживаемости клеток (фиг. 2). Полученная кривая доза-эффект показывает, что эффективное подавление их нагревания при 44°С в течение 20 мин и последующего облучения начинается с дозы облучения 2 Гр и нарастает по мере увеличения дозы облучения (2-10 Гр). Полученная кривая доза-эффект позволяет прогнозировать результаты комбинированного воздействия разных режимов облучения и нагревания для клеток термоустойчивых опухолей.

П р и м е р 3. Для скрининга химиотера- певтических препаратов, подавляющих рост и метастазирование опухолей человека, устойчивых к термотерапии, суспензию одиночных опухолевых клеток термоустойчивого штамма РА-22 концентрация клеток 100000/мл в среде Игла вводили внутривенно каждую пробу белым беспородным крысам (0,2 мл на животное): 10 животных - на каждый вариант опыта и 10 животных - на контроль. Через разные сроки после внутривенной перевивки (5, 10 и 14 сут) внутри- брюшинно вводили сарколизин в дозах 10, 20 и 30 мг/кг и через 21 сут после внутривенной перевивки животных контрольной и опытной групп забивали, извлекали легкие, вылущивали клоны, подсчитывали их количество и взвешивали на торзионных весах, и затем определяли количество колониеоб- разующих единиц (КОЕ) и торможение роста опухоли по общепринятым методикам.

Сарколизин, введенный в указанных дозах, оказывает заметное влияние на динамику изменения массы клонов и на количество клонов в легких, однако терапевтический эффект в значительной степени зависит от дозы препарата и режима его

введения. Процент торможения роста опухоли в опыте при использовании показателя (средняя масса клонов) изменялся от 7,7 до 73,4%, при использовании показателя 5 количество клонов на легкое - от 16,2 до 96,3%, при использовании показателя масса опухолевой ткани на одно легкое от 51,5 до 96,2%. Наблюдающиеся в опытах изменения клонов по количеству и массе позво0 ляют выявить высокую степень гетерогенности популяции клеток термоустойчивых опухолей по чувствительности к сарколизину и определить, что значительную часть популяции составляют клоны,

5 способные репопулировать после терапевтического воздействия. Таким образом, использование термоустойчивого штамма РА-22 позволяет более дифференцированно изучать закономерности влияния химиоте0 рапевтических препаратов на опухоли, устойчивые к термотерапии, выявлять особенности и динамику этих воздействий. Таким образом, предлагаемый штамм, как было установлено в экспериментах, по5 ставленных с 10 по 60 пассаж селекции,

обладает более высокой колониеобразую щей способностью (КОЕ 0,16±0,08) по

сравнению с прототипом - термочувстви тельным штаммом (КОЕ 0,13±0,006). Дан0 ный штамм обладает почти в 3 раза более высокой термоустойчивостью (До 13,5 мин), чем прототип - термочувствительный штамм (До 4,1 мин). Радиоустойчивость заявляемого штамма (До 2,4 Гр) примерно

5 в 1,5 раза больше, чем радиоустойчивость штамма - прототипа (Д0 1,6 Гр).

Из этого следует, что предлагаемый штамм является удобной моделью для изучения процесса метастазирования и испы0 тания химиотерапевтических препаратов для опухолей с повышенной термоустойчивостью и радиоустойчивостью, и поэтому не чувствительных к лечению гипертермией и радиотерапией.

5 Фор мула изобретения

Штамм культивируемых клеток рабдо- миосаркомы крыс РА-22 № 13-9-3 (Банк опухолевых штаммов ВОНЦ АМН СССР), используемый для выявления особенностей

0 опухолей, устойчивых к лечению гипертермией.

Фракция

выживших

клеток

10°

Использование: медицина, экспериментальная онкология, Сущность изобретения: получен в процессе многоступенчатой селекции (78 циклов отбора) на устойчивость к термальным воздействиям клеток штамма рабдомиосаркомы РА-21, полученного на основе штамма рабдомиосаркомы аффини- тетной РА-2. Штамм пассируется на белых беспородных крысах путем внутривенного введения суспензии одиночных клеток через каждые 20 дней. Штамм обладает высокой термоустойчивостью и радиоустойчивостью, является удобной моделью для изучения процесса метастазирования и испытания химиотерапевтических препаратов для опухолей с повышенной термо- и радиоустойчивостью, не чувствительных к лечению гипертермией и радиотерапией. 2 ил,

10 1(Г3 10

Фракция выживших

К-ЛЭТСЖ

10

10

1 2 3 Ч 5 6 7 « $10

:. : :.; :::::: f-Vi:;;i|::;:

fp