СПОСОБ КОНТРОЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ НЕЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ХИМИЧЕСКИ ИДЕНТИЧНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/15 

Изобретение относится к биофармации, в частности к методам определения неэквивалентности химически идентичных лекарственных веществ, и может быть использовано при контроле качества лекарственных средств в химико-фармацевтической промышленности и медицине.

Известно, что химически идентичные лекарственные средства разных изготовителей, а часто разные партии одного и того же изготовителя могут проявлять неодинаковые физико-химические, биофармацевтические (in vitro, in vivo) и терапевтические свойства. Это явление получило название биологической неэквивалентности.

Бионеэквивалентность лекарственных средств приводит к тому, что препарат, отвечая всем требованиям соответствующей нормативно-технической документации, в том числе Государственной Фармакопее СССР ХI издания, проявляет или снижение терапевтического эффекта, или гиперэффект.

В связи с вышеизложенным необходимость разработки экспрессных методов выявления биологической неэквивалентности химически идентичных лекарственных веществ является чрезвычайно актуальной.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения биологической неэквивалентности химически идентичных лекарственных средств с применением метода рефрактометрии (прототип). Способ заключается в том, что готовят равные растворы испытуемого и стандартного образцов, измеряют показатели преломления на рефрактометре и по отклонению показателя преломления раствора испытуемого образца от показателя преломления раствора стандартного образца устанавливают наличие неэквивалентности.

Известный способ прост, доступен для использования в лабораториях, однако имеет низкую чувствительность, так как отклонение показателей преломления можно уловить в растворе с концентрацией вещества не ниже 3%. В связи с низкой чувствительностью этого способа неэквивалентность не может быть определена у ряда лекарственных веществ, имеющих малую растворимость, концентрация которых в растворе не достигает 3%.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Цель достигается за счет того, что в одинаковых условиях готовят растворы равной концентрации стандартного и испытуемого образцов, измеряют оптический параметр, при этом в качестве оптического параметра используют удельный показатель поглощения, рассчитанный по оптической плотности, измеренной при длине волны, в которой оптическая плотность имеет максимальную разность и наличие разности удельных показателей поглощения свидетельствует о биологической неэквивалентности образцов.

Предложенный способ в отличие от известного позволяет определить неэквивалентность химически идентичных лекарственных веществ в растворах с концентрацией 1˙10^-4%.

Таким образом, чувствительность предложенного способа повышается, в сравнении с прототипом, в тысячи раз. Кроме того, предложенный способ расширяет спектр исследуемых лекарственных веществ за счет возможности определения неэквивалентности малорастворимых соединений.

Для установления наличия биологической неэквивалентности химически идентичных лекарственных веществ определяют оптическую плотность растворов стандартного и испытуемого образцов при длине волны, для которой различие в отклонениях значений оптических плотностей является наибольшим, рассчитывают величины удельного показателя поглощения для каждого раствора и сравнивают эти величины. По отклонению удельного показателя преломления испытуемого образца относительно стандартного судят о его биологической неэквивалентности.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Определение биологической неэквивалентности образцов метилурацила предлагаемым способом.

Испытуемый образец метилурацила (2,4-диоксо-6-метил-1,2,3,4-тетрагидропир- имидин) получают по известной методике, заключающейся в быстрой кристаллизации водного раствора метилурацила, соответствующего всем требованиям ФС 42-2255-84. Испытуемый и стандартный образцы высушивают при 105^оС до постоянной массы. Все образцы соответствуют требованиям ФС 42-2255-84 и имеют чистоту 99,8%.

Затем готовят растворы образцов метилурацила следующим образом. Точную навеску стандартного или испытуемого образцов метилурацила в количестве 0,0250 г помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в этаноле, объем раствора доводят этанолом до метки и тщательно перемешивают. 5,0 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора этанолом до метки и тщательно перемешивают. 2,5 мл последнего раствора переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора этанолом до метки и тщательно перемешивают (концентрация растворов равна 0,001%).

Аналогично готовят этанольные растворы стандартного и испытуемого образцов метилурацила следующих концентраций: 0,00108; 0,00116; 0,00124; 0,00132%.

Определяют значения оптической плотности этанольных растворов стандартного и испытуемого образцов метилурацила всех концентраций в строго идентичных условиях на спектрофотометре при длине волны 260 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения - этанол.

Вычисляют значения удельного показателя поглощения растворов стандартного и испытуемого образцов метилурацила каждой концентрации по формуле:
E1%1с

Полученные значения удельного показателя поглощения этанольных растворов стандартного и испытуемого образцов метилурацила подвергают статистической обработке.

Вычисляют разность (Δ) между значениями удельных показателей поглощения этанольных растворов стандартного (Y_i) и испытуемого (Z_i) образцов метилурацила для каждого опыта:
Δ =Y_i-Z_i.

Достоверность результатов рассчитывают статистически, сравнивая расчетный и табличный критерии Стьюдента, при условии, что t_{расчетн.}>t_{табличн.} делают вывод о наличии биологической неэквивалентности.

Полученные данные представлены в табл. 1, которые свидетельствуют о наличии биологической неэквивалентности между испытуемым и стандартным образцами метилурацила.

Определение неэквивалентности образцов метилурацила на модели линейных ран.

Опыты проводят на 21 белой беспородной крысе (самцы) массой 180-220 г. Экспериментальной моделью служат линейные раны длиной 50 мм, которые наносят на спины крыс. Животных обкалывают 1 раз в день физиологическим раствором в количестве 0,5 мл в течение 3 дней. Во второй серии раны обкалывают по той же методике 1%-ным раствором стандартного образца метилурацила в физиологическом растворе. В третьей серии раны обкалывают по той же методике 0,25%-ным раствором испытуемого образца метилурацила в физиологическом растворе. Выбор концентраций обусловлен предварительными испытаниями, где было показано, что ранозаживляющий эффект стандартного образца метилурацила проявляется лишь при использовании раствора с концентрацией 1% , а сравниваемый ранозаживляющий эффект испытуемого образца метилурацила проявляется при использовании раствора с концентрацией 0,25%.

Ранозаживляющую активность образцов метилурацила оценивают по прочности рубца на растяжение. Получены следующие результаты: в 1-й серии - 30,1±1,3 г/мм². во второй - 40,1±5,0 г/мм² и в 3-й - 57,3± ±9,0 г/мм², из которых видно, что применение стандартного образца метилурацила увеличивает прочность рубца на 33,2%, а испытуемого образца в концентрации в 4 раза меньшей - на 90,4%.

Полученные данные доказывают биологическую неэквивалентность испытуемого образца стандартному образцу метилурацила.

П р и м е р 2. Определение биологической неэквивалентности образцов дикаина предлагаемым способом.

Испытуемый образец получают рекристаллизацией дикаина (2-диметиламиноэтилового эфира п-бутиламинобензойной кислоты гидрохлорид), соответствующего всем требованиям ст. 214 ГФ Х изд., из воды. Испытуемый и стандартный образцы дикаина были высушены при 105^оС до постоянной массы. Все образцы соответствовали требованиям ст. 214 ГФ Х изд. и имели чистоту 99,9%.

Затем готовят растворы образцов дикаина следующим образом. Точную навеску стандартного или испытуемого образцов дикаина в количестве 0,0250 г помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в этаноле, объем раствора доводят этанолом до метки и тщательно перемешивают. Далее поступают, как описано в примере 1. Концентрация растворов дикаина равна 0,001%.

Аналогично готовят этанольные растворы стандартного и испытуемого образцов дикаина следующих концентраций: 0,00068; 0,00076; 0,00084; 0,00092%.

Определяют значения оптической плотности этанольных растворов стандартного и испытуемого образцов дикаина всех концентраций в строго идентичных условиях на спектрофотометре при длине волны 310 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения - этанол.

Вычисляют значения удельного показателя поглощения растворов стандартного и испытуемого образцов дикаина каждой концентрации по вышеприведенной формуле (в примере 1) и подвергают их статистической обработке. Далее поступают аналогично примеру 1.

Полученные данные представлены в табл. 2, которые свидетельствуют о наличии биологической неэквивалентности между испытуемым и стандартным образцами дикаина.

Определение биологической неэквивалентности образцов дикаина по продолжительности их анестезирующего действия на глаз кролика (метод Ренье)
Проводят исследования анестезирующего действия 1%-ного раствора стандартного образца дикаина и 0,3% раствора испытуемого образца дикаина на 44 кроликах породы шиншилла. Каждый из растворов закапывают в глаз по 0,06 мл (2 капли) и определяют продолжительность наступавшей анестезии методом касания роговицы глаза животного. Длительность анестезии определяют по секундомеру. Стандартный образец дикаина в концентрации 1% проявляет местно-анестезирующую активность длительностью 61,3±4,0 мин. Испытуемый образец дикаина имеет статистически не различающуюся продолжительность местной анестезии 55,2±1,7 мин (р>0,1) в концентрации 0,3%. Кроме того, при одинаковой продолжительности анестезии испытуемый образец в концентрации 0,3% не вызывает визуально наблюдаемых побочных действий, характерных для 1%-ного раствора стандартного образца дикаина.

Полученные результаты свидетельствуют о бионеэквивалентности испытуемого образца стандартному образцу дикаина.

Предлагаемый способ, по сравнению с известным, позволит в тысячи раз повысить чувствительность определения биологической неэквивалентности и за счет этого расширить спектр исследуемых лекарственных веществ.

Использование: в аналитической химии. Сущность изобретения: готовят растворы стандартного и испытуемого образцов, измеряют удельный показатель поглощения, рассчитанный по оптической плотности, измеренной при длине волны, в которой оптическая плотность имеет максимальную разность и наличие разности удельных показателей поглощения свидетельствует о биологической неэквивалентности образцов. 2 табл.

СПОСОБ КОНТРОЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ НЕЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ХИМИЧЕСКИ ИДЕНТИЧНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, включающий приготовление растворов стандартного и испытуемого образцов, измерение оптического параметра и его отклонений от стандартного образца, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве оптического параметра используют удельный показатель поглощения, рассчитанный по оптической плотности, измеренной при длине волны, в которой оптическая плотность имеет максимальную разность, и наличие разности удельных показателей поглощения свидетельствует о биологической неэквивалентности образцов.