СПОСОБ КОНТРОЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ НЕЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ХИМИЧЕСКИ ИДЕНТИЧНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/15 

Изобретение относится к области биофармации, касается методов определения неэквивалентности химически идентичных лекарственных средств и может быть использовано при контроле их качества.

Известно, что химически идентичные лекарственные средства разных изготовителей, а часто разные партии одного и того же изготовителя, могут проявлять неодинаковые физико-химические, биофармацевтические (in vivo, in vitro) и терапевтические свойства. Это явление получило название биологической неэквивалентности [1-3].

Бионеэквивалентность лекарственных средств приводит к тому, что препарат, отвечая всем требованиям соответствующей нормативно-технической документации, проявляет или снижение терапевтического эффекта, или гиперэффект [2.3].

В связи с вышеизложенным необходимость разработки экспрессных методов выявления биологической неэквивалентности химически идентичных лекарственных веществ является чрезвычайно актуальной.

Известен способ определения биологической неэквивалентности химически идентичных лекарственных средств, принятый за прототип [4]. Способ заключается в том, что готовят в равных условиях растворы испытуемого и стандартного образцов лекарственного вещества, затем помещают в эти растворы Paramecium caudatum и по различию двигательной активности простейших судят о наличии биологической неэквивалентности.

Известный способ основан на принципе проникновения лекарственного вещества из раствора через живую ткань (биомембрану) в клетки простейшего организма Paramecium caudatum и сравнения действия на двигательную функцию испытуемого и стандартного химически идентичного лекарственного средства.

В связи с необходимостью использования простейших организмов известный способ сложен и неудобен при проведении повсеместного контроля качества лекарственных средств. Кроме того, указанный способ характеризуется невысокой надежностью определения биологической неэквивалентности, так как основан на субъективном методе анализа результатов по изменению двигательной активности простейших. Субъективная оценка ненадежная и не дает точных результатов.

Целью изобретения является устранение перечисленных недостатков, а именно упрощение и повышение надежности и точности способа определения биологической неэквивалентности химически идентичных лекарственных средств.

Цель достигается за счет того, что в одинаковых условиях готовят растворы равной концентрации испытуемого и стандартного образцов лекарственного средства, помещают полученные растворы в емкости с полупроницаемой мембраной, измеряют величину изменения скорости диффузии и наличие разности указанных величин свидетельствует о биологической неэквивалентности образцов.

Предложенный способ контроля состоит в том, что в емкости с полупроницаемой мембраной помещают чистые растворы испытуемого и стандартного образцов химически идентичных лекарственных веществ, осуществляют диализ в жидкую среду, через равные промежутки времени определяют в жидкой среде концентрацию лекарственного вещества стандартного и испытуемого образцов и по разнице концентраций судят о наличии биологической неэквивалентности.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Определение биологической неэквивалентности образцов метилурацила предложенным способом.

Испытуемый образец метилурацила (2,4-диокси-6-метил-1,2,3,4-тетрагидропир- имидин) получают согласно методике [5], заключающейся в быстрой кристаллизации метилурацила из водного раствора. Испытуемый и стандартный образцы метилурацила химически идентичны и соответствуют требованиям ФС 42-2255-84.

Испытуемый и стандартный образцы высушивают при 105^оС до постоянной массы; чистота 99,8%.

Растворяют точные навески испытуемого и стандартного образцов метилурацила, каждая по 0,05 г, в 25 мл воды и помещают каждый из растворов в отдельные емкости с мембраной из целлофана, площадью 706 мм². Затем опускают их в отдельные термостатированные сосуды с водой. Объем воды в сосуде составляет 25 мл, глубина погружения 3 мм. Через 15, 30, 60, 90, 120, 150 мин из сосудов проводят забор проб по 1 мл, возвращая туда же по 1 мл воды. Доводят объем взятых проб водой до 10 мл и определяют концентрацию метилурацила в пробах спектрофотометрическим методом при длине волны 231 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, контроль - вода. Расчет проводят по калибровочному графику зависимости оптической плотности растворов метилурацила от его концентрации.

Построение калибровочного графика:
0,1 г (точная навеска) метилурацила растворяют в воде в колбе вместимостью 100 мл (раствор "А"). Затем 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0. 2,0 мл раствора А помещают в колбу вместимостью 100 мл, доводят объем растворов водой до метки и тщательно перемешивают (раствор Б). Концентрация метилурацила в растворах Б составляла 1,0; 3,0; 5,0; 7,0; 10,0; 20,0 мкг/мл соответственно. Для каждой концентрации проводят 3 параллельных определения, каждый раз используя вновь приготовленный раствор Б.

Растворы метилурацила в указанных концентрациях имели следующие средние значения оптической плотности: 1 мкг/мл - 0,022; 3 мкг/мл - 0 ,052; 5 мкг/мл - 0,088; 7 мкг/мл - 0,121; 10 мкг/мл - 0,173; 20 мкг/мл - 0,352.

Расчет количества продифундированного метилурацила через мембрану во времени (на примере 15- и 30-минутной экспозиции).

Для стандартного образца метилурацила значения оптических плотностей растворов составляли через 15 мин 0,23; 0,22; 0,17 (среднее 0,21); для испытуемого образца метилурацила - 0,26; 0,27; 0,25 (среднее 0,26). Указанным средним значениям оптических плотностей соответствовали, исходя из калибровочного графика, значения концентраций метилурацила стандартного образца - 11,43 мкг/мл; испытуемого образца - 15,06 мкг/мл.

Через 30 мин для стандартного образца значения оптических плотностей растворов составляли 0,31; 0,25; 0,36 (среднее 0,30); для испытуемого образца - 0,35; 0,40; 0,31 (среднее 0,35).

Указанным средним значениям оптических плотностей соответствовали, исходя из графика, значения концентраций метилурацила стандартного образца 16,48 мкг/мл, испытуемого образца - 19,50 мкг/мл.

Аналогично определяют количество продифундированного метилурацила из раствора стандартного и испытуемого образцов через остальные интервалы времени.

Различия указанных концентраций свидетельствуют о биологической неэквивалентности испытуемого образца относительно стандартного.

Данные эксперимента приведены в табл. 1.

Из данных табл. 1 видно, что все значения концентраций испытуемого образца метилурацила имеют значительные отклонения от соответствующих значений стандартного образца.

Биологическую неэквивалентность двух образцов метилурацила определяли также путем диффузии раствором через биомембрану - изолированную прямую кишку крысы.

На проксимальный отдел кишки накладывали лигатуру, после чего внутрь кишки шприцем вводили раствор испытуемого или стандартного образца метилурацила (0,05 г в 0,5 мл воды). После заполнения кишки на дистальный отдел также накладывали лигатуру. Кишку с испытуемой пробой и кишку со стандартной помещали в отдельные стаканы, содержащие по 50 мл физиологического раствора. Вся система помещалась в термостат при 37^оС, содержимое стаканов периодически аэрировалось. Через определенные интервалы времени из стаканов брали пробы объемом по 3 мл, добавляя обратно в стаканы по 3 мл физиологического раствора. К взятым пробам добавляли по 1 мл 15%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, после чего проводили фильтрование раствора через бумажный фильтр. 1 мл фильтрата доводили водой до 10 мл и проводили измерение оптической плотности при длине волны 231 нм на двухлучевом спектрофотометре Schimadzu (Япония).

В качестве контроля использовали пробы из прямой кишки - плацебо, взятые и обработанные по вышеприведенной схеме.

Определение концентрации метилурацила вели аналогично предыдущему опыту по калибровочному графику.

Данные эксперимента приведены в табл. 2.

Полученные результаты свидетельствуют о биологической неэквивалентности испытуемого образца метилурацила стандартному.

Для подтверждения биологической неэквивалентности испытуемого образца стандартному образцу параллельно проведено изучение влияния этих образцов метилурацила на заживление линейных ран у крыс.

Определение биологической неэквивалентности образцов метилурацила на модели линейных ран [5].

Опыты проводят на 21 белой беспородной крысе (самцы) массой 180-220 г. Экспериментальной моделью служат линейные раны длиной 50 мм, которые наносят на спины крыс. Животных разделяют на 3 серии. Первая серия - контрольная - раны обкалывают 1 раз в день физиологическим раствором в количестве 0,5 мл в течение 3 дней. Во второй серии раны обкалывают по той же методике 1% -ным раствором стандартного образца метилурацила в физиологическом растворе. В третьей серии раны обкалывают по той же методике 0,25%-ным раствором испытуемого образца метилурацила в физиологическом растворе. Выбор концентраций обусловлен предварительными испытаниями, где было показано, что ранозаживляющий эффект стандартного образца метилурацила проявляется лишь при использовании раствора с концентрацией 1%, а сравниваемый ранозаживляющий эффект испытуемого образца метилурацила проявляется при использовании раствора с концентрацией 0,25%.

Ранозаживляющую активность образцов метилурацила оценивают по прочности рубца на растяжение. Получены следующие результаты: в 1 серии - 30,1±1,3 г/мм², во второй - 40,1±5,0 г/мм² и в 3 - 57,3±9,0 г/мм², из которых видно, что применение стандартного образца метилурацила увеличивает прочность рубца на 33,2% . а испытуемого образца в концентрации в 4 раза меньшей на 90,4%.

Полученные данные доказывают биологическую неэквивалентность испытуемого образца стандартному образцу метилурацила.

П р и м е р 2. Определение биологической неэквивалентности образцов стрептоцида предложенным способом.

Берут два образца: стандартный и испытуемый образцы химически идентичного лекарственного вещества - стрептоцида (п-аминобензолсульфамида). Стрептоцид, используемый в качестве испытуемого образца, получен из промышленного кристаллизацией его водного раствора в жидком гексане [6]. Испытуемый и стандартный образцы стрептоцида соответствуют требованиям ГФ СССР Х изд. Растворяют точные навески образцов стрептоцида каждая по 0,06 г в 12,5 мл воды, помещают каждый из растворов в емкости с мембраной из целлофана, площадью 706 мм², затем опускают их в сосуды, содержащие по 40 мл 0,01М раствора едкого натра. Сосуды помещают в термостат и через 15, 30, 60, 90, 120, 150 мин проводят забор проб по 0,2 мл, возвращая туда же 0,2 мл 0,01М раствора едкого натра. В пробах определяют концентрацию стрептоцида известным фотоколориметрическим методом [7].

Расчет количества продифундированного стрептоцида через мембрану во времени (на примере 15 и 30-минутной экспозиции).

Для стандартного образца значения оптических плотностей растворов составляли через 15 мин, 0,25; 0,18; 0,28 (среднее 0,24). Для испытуемого образца стрептоцида значения оптических плотностей растворов составляли через 15 мин 0,49; 0,39; 0,58 (среднее 0,48). Указанным средним значениям оптических плотностей соответствовали, исходя из калибровочного графика, значения концентраций стандартного образца стрептоцида 9,46 мкг/мл; испытуемого - 19,73 мкг/мл.

Через 30 мин для стандартного образца значения оптических плотностей растворов составляли 0,41; 0,34; 0,53 (среднее 0,42); для испытуемого образца - 0,59; 0,68; 0,66 (среднее 0,64). Указанным средним значениям оптических плотностей соответствовали, исходя из калибровочного графика, значения концентраций стрептоцида: стандартного - 16,92 мкг/мл; испытуемого - 26,25 мкг/мл.

Данные эксперимента представлены в табл. 3.

Из данных табл. 3 видно, что все значения концентраций испытуемого образца стрептоцида имеют значительные отклонения от соответствующих значений стандартного образца. Различия указанных концентраций свидетельствуют о биологической неэквивалентности испытуемого образца стрептоцида относительно стандартного.

Биологическую неэквивалентность двух образцов стрептоцида определяли также путем диффузии через изолированную прямую кишку крысы - биомембрану.

На проксимальный отдел кишки накладывали лигатуру, после чего внутрь кишки шприцем вводили 0,05 г субстанций стрептоцида испытуемого или стандартного образцов в 1 мл воды. После заполнения кишки на дистальный отдел также накладывали лигатуру. Кишку с испытуемой пробой и кишку со стандартной помещали в отдельные стаканы, содержащие по 40 мл раствора Рингера. Всю систему помещали в термостат при температуре 37^оС. Содержимое стаканов периодически аэрировалось. Через определенные интервалы времени из стаканов брали пробы объемом по 1 мл, добавляя обратно в стаканы по 1 мл раствора Рингера.

В 0,2 мл из взятой пробы вели определение стрептоцида известным фотоколориметрическим методом [7].

В качестве контроля использовали пробы из прямой кишки - плацебо, взятые по вышеприведенной схеме.

Определение концентраций стрептоцида вели по калибровочному графику.

Данные приведены в табл. 4.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии биологической неэквивалентности испытуемого и стандартного образцов стрептоцида.

Для подтверждения биологической неэквивалентности испытуемого образца стрептоцида стандартному образцу параллельно проведено определение их фармакокинетики на кроликах.

Определение бионеэквивалентности образцов стрептоцида в фармакокинетических опытах на кроликах.

В двух сериях опытов (по 5 кроликов в каждой) животным перорально вводят 21 мл 0,46%-ного водного раствора испытуемого и стандартного образцов стрептоцида. Растворы готовят непосредственно перед введением. Через 0,5; 1; 2; 4; 6 ч после введения растворов из краевой ушной вены кроликов берут по 1 мл крови в 15 мл воды. По окончании гемолиза добавляют 4 мл 15%-ной трихлоруксусной кислоты. Смесь перемешивают и фильтруют. В 2,5 мл фильтрата фотоколориметрическим методом при зеленом светофильтре определяют оптическую плотность раствора, а затем по калибровочному графику содержание стрептоцида.

Содержание стрептоцида в 1 мл крови вычисляют по формуле
X,мкг/мл =
С - концентрация стрептоцида, найденная по графику;
b - общий объем раствора (15 мл воды + 1 мл крови + 4 мл 15%-ной трихлоруксусной кислоты);
К - количество крови, на которое проводят расчет;
b₁ - объем фильтрата, взятый на анализ (2,5 мл);
а - объем крови в опыте (1 мл).

Результаты экспериментов представлены в таблице 5.

Анализ экспериментальных данных показывает существенные различия в фармакокинетических показателях, особенно на стадии всасывания. В период всасывания концентрации стрептоцида в крови испытуемого образца значительно превышают таковые у стандартного образца. Кроме того, время достижения максимальной концентрации для стандартного образца составляет 2 часа, в то время как для испытуемого образца оно составляет 1 час.

Полученные данные доказывают биологическую неэквивалентность испытуемого и стандартного образцов и подтверждают вышеуказанные результаты заявляемого способа.

Применение заявляемого способа позволяет повысить точность методики определения биологической неэквивалентности химически идентичных лекарственных веществ, так как основывается на сопоставительном анализе измеряемых цифровых величин, а не на субъективной оценке результатов по двигательной активности простейших, что имеет место в известном способе (прототипе). Кроме того, заявляемый способ характеризуется упрощенной методикой определения биологической неэквивалентности, так как исключает использование живых организмов, применяемых в известном способе.

Использование: в аналитической химии. Сущность изобретения: готовят растворы анализируемого и стандартного образцов, полученные растворы помещают в емкость с полупроницаемой мембраной, измеряют величину изменения скорости диффузии, наличие разности указанных величин свидетельствует о биологической неэквивалентности образцов. 5 табл.

СПОСОБ КОНТРОЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ НЕЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ХИМИЧЕСКИ ИДЕНТИЧНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, включающий приготовление растворов анализируемого и стандартного образцов, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, полученные растворы помещают в емкость с полупроницаемой мембраной, измеряют величину изменения скорости диффузии, наличие разности указанных величин свидетельствует о биологической неэквивалентности образцов.