ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIUM KRESTOVNIKOVA - TROITSKAYA, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА Российский патент 1995 года по МПК C12N1/20 A61K39/40 C12N1/20 C12R1/15 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для получения вакцины, обладающей иммуногенными свойствами против различных форм новообразований: лейкозов, рака молочной железы, яичников, желудка и т.д.

В настоящее время для лечения онкологических больных применяют неидентифицированные штаммы рода коринебактерий в виде аутовакцины [1 и 2].

Для лечения больных с новообразованиями мочевого пузыря применяют штамм БЦЖ с иммуногенными свойствами против туберкулеза. Штамм выделен от больного туберкулезом животного и представляет собою грамположительные палочки, характеризующиеся медленным, 18-20 дней, ростом на специальных питательных средах [3].

Штамм БЦЖ (Mycobacterium bovis Кальмета и Герена) будучи вакцинным, применяют как живую вакцину для создания специфического иммунитета против туберкулеза. Штамм обладает способностью повышать резистентность микроорганизма путем активации общих иммунологических реакций наряду со специфическим действием, выраженным в развитии поствакцинального специфического иммунитета против туберкулеза.

Недостатком вакцины БЦЖ, полученной из указанного штамма, при лечении онкологических больных является введение больших доз и реактогенность в виде резкого повышения температуры тела до 39-40^оС при первых двух-трех введениях препарата, а также способность вызывать аллергию организма.

Целью изобретения является получение штамма Corynebacterium Krestovnikova-Troitscaya N277 (коринебактерий КТ-227) нереактогенного, с малой аллергогенностью, стимулирующего неспецифическую резистентность и иммунореактивность организма, эффективного в малых дозах неспецифической терапии больных с разными формами новообразований за счет повышения общей неспецифической реактивности и опосредственного усиления специфических иммунных реакций, род штамма Corynebacterium, вид Krestovnikova-Troitskaya N227.

Указанная цель достигается тем, что для вакцинотерапии больных с новообразованиями предложен штамм грам (+) бактерий (коринебактерий КТ-227) Corynebacterium Krestovnikova-Troitskaya N227, полученный из крови онкологической больной Cr.Mammae.

Штамм коринебактерий КТ-227 хранится в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартиза- ции и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под номером 227.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки палочковидной формы, неподвижные, бескапсульные, грамположительные, на плотных питательных средах образуют точечные круглые прозрачные колонии диаметром 0,5 мм. Окраска по Граму положительная.

Штамм после регидрации растет в аэробных условиях на питательном агаре рН 7,6-7,8 с добавлением 0,2% глюкозы и 10% инактивированной лошадиной сыворотки или Твин 80 (0,05%). Температура роста составляет 37^оС. Продолжительность роста 24-48 ч. Штамм обладает кремовым пигментом на средах с сывороткой, желтым - на средах с Твином.

Биохимические свойства.

Штамм не утилизирует манит, галактозу, сахарозу, лактозу, рафинозу, инулин, ремнозу, дульцит, адонит, ксилозу, рабозу, арабинозу, сорбит, крахмал. Утилизирует до образования кислоты глюкозу и мальтозу. Обладает ферментом каталазой.

Не обладает ферментами: желатиназой, уреазой, оксидазой, не гемолизирует эритроциты крови, не вырабатывает индола и сероводорода. Не редуцирует нитраты.

Чувствительность штамма к антибиотикам изучали дискодиффузионным методом. Штамм чувствителен к оксиллину, ампициллину, ристомицину, полимексину, бензилпенициллину, карбенициллину, метициллину, эритромицину, тетрациклину, олеандомицину, гентамицину, канамицину, неомицину, мономицину, стрептомицину [4 и 5].

Штамм хранится в ампулах, сохраняет жизнеспособность в результате лиофильного высушивания из замороженного состояния в защитной сахарозожелатиновой среде.

Штамм обладает онколитической активностью, равной 98± 2% [6]. (В качестве опухолевой модели использован штамм саркомы).

П р и м е р. Для получения штамма коринебактерий КТ-227 берут питательный агар рН 7,6-7,8 с 0,2% глюкозы, 10% инактивированной лошадиной сыворотки или 0,05% Твин 80, инкубация при 37^оС 24-48 ч.

Для получения вакцины из штамма культуру выращивают на специальной питательной среде. Полученную биомассу смывают стерильным раствором, расфасовывают в ампулы и запаивают.

Для подтверждения возможности использования в качестве вакцинных, из числа изученных культур отобрали наиболее типичные, обладающие определенным уровнем иммуностимулирующего эффекта, выявленного в опытах на животных. Они в дальнейшем были использованы в качестве вакцины для приготовления иммуностимулятора.

Изучено модулирующее действие препарат "ин виво" на мышах. В результате проведенных исследований показано, что препарат обладает иммуностимулирующим действием в отношении IgY антителообразования. Наибольший иммуностимулирующий эффект обнаружен при использовании препарата в день иммунизации. Полученные данные указывают на выраженное иммуностимулирующее действие препарата. При этом данный эффект проявляется в отношении индуктивной фазы иммунного ответа.

В опытах на мышах разных линий со спонтанно развивающимися опухолями, а также зараженных опухолевой взвесью штамма саркомы С-180 и на модели перевиваемого гемоцитобластоза показано, что применение вакцины из штамма привело в первом случае к увеличению инкубационного периода или предотвращению развития спонтанной лейкемии и увеличению продолжительности жизни заболевших животных. У зараженных опухолевым штаммом животных применение вакцины способствовало восстановлению иммунологической неспецифической резистентности и снижению процента заболевших животных. В связи с восстановлением иммунологической неспецифической резистентности рост опухоли тормозился от 74 до 56,6% в зависимости от сроков и путей введения препаратов.

Для гистологического исследования брали место введения, внутренние органы и органы иммуногенеза. Было установлено, что на фоне уменьшения перекисного окисления липидов (ПОЛ) и увеличения количества SH-групп в тканях селезенки, печени происходила активация механизмов, тормозящих рост перевиваемых опухолей.

При оценке безвредности в экспериментах на лаборатоpных животных была проверена острая и хроническая токсичность вакцинного штамма. Как штаммы, так и вакцина через 24 ч после внутривенного введения в опытах по изучению острого токсического действия вызывали небольшие очаговые реактивные изменения в легочной паренхиме, которые сводились к умеренному отеку межальвеолярных перегородок с инфильтрацией их преимущественно лимфоидными и микрофагальными элементами. Указанная реакция исчезала и не регистрировалась через 7 сут после внутривенного введения указанных реагентов. Каких-либо нарушений в других внутренних органах (ЦНС, сердце, печени, почках, поджелудочной железе, надпочечниках, кишечнике) установлено не было. В органах иммунной системы не было отмечено никаких патологических реакций.

При однократном введении внутримышечно штамма и вакцины в опытах по острой токсичности изменения были обнаружены через 24 ч после инъекции в месте введения, где возникала очаговая лейкоцитарная инфильтрация и деструкция отдельных мышечных элементов. Эти изменения сопровождались умеренной гиперплазией регионарных лимфатических узлов без нарушения их структуры и миелоза. В легочной ткани в этот срок реактивные изменения с инфильтрацией межальвеолярных перегородок были зарегистрированы у животных, получивших вакцину. В других органах и иммунной системе были выявлены отклонения от нормы. По происшествии 7 суток после внутримышечной инъекции штамма и вакцины признаков патологических сдвигов как в месте введения, так и в других изученных органах отмечено не было.

Десятикратное внутримышечное введение штамма и вакцины в опытах хронической токсичности не приводило к развитию каких-либо нарушений как в месте введения, так и в других органах иммунной системы.

Полученные данные убедительно показывают отсутствие токсического действия используемых доз в опытах по изучению острой и хронической токсичности штамма коринебактерий КТ-227 и вакцины, приготовленной на его основе.

Данные об активации иммунной системы, косвенно обеспечивающей защиту от злокачественного агента.

Штамм предлагается в качестве вакцинного (как препарат, обладающий способностью к нормализации клеточного и гуморального иммунитета) для неспецифической терапии больных, в частности с различными формами новообразований.

В связи с тем, что приготовленная вакцина из штамма не обладает специфическим лечебным воздействием на рост, а влияет опосредованно через нормализацию иммунной системы (гуморальной и клеточной) путем восстановления естественной резистентности к опухолевому процессу, вакцина была обозначена как иммуностимулятор с названием "кориностим". Его рекомендуется применять в комплексной терапии с другими лекарственными препаратами.

При оценке иммуностимулирующего эффекта проводились исследования на двух группах онкологических больных, леченых двумя способами.

Первая группа (контрольная) - 27 человек, вторая группа (леченая препаратом) - 23 человека. Определялась функциональная активность нейтрофилов и моноцитов и некоторые другие характеристики клеточного иммунитета. Гумбральный иммунитет определялся уровнем иммуноглобулинов классов I, A, M, IgE.

Показано, что две группы достоверно различаются, причем достоверность различий сохраняется, даже если показатели иммунитета разделены на две группы: гуморальный и клеточный. В группе леченых препаратом по сравнению с контрольной выявлены достоверные различия: снижение уровня IgA, процента Т-лимфоцитов, повышение показателей кислородозависимой бактерицидности при нагрузке препаратом. Причиной достоверных различий иммунологических показателей в этих двух группах следует считать применение в одной из них препарата.

Следует вывод, что данный препарат обладает иммуномодулирующим действием. Одним из гипотетических механизмов действия данного препарата на иммунную систему является активация нормальных К-клеток, которая становится возможной благодаря практически полной элиминации супрессоров.

Данные о повышении неспецифических факторов защиты после введения предлагаемого штамма.

Экспериментальные исследования и длительное лечение онкологических больных аутовакцинами из данного вида бактерий, а также ограниченные клинические испытания по лечению 52 больных коринестимом позволяют сделать заключение об эффективности применения препарата в комплексном лечении больных с онкологическими заболеваниями, которая проявляется в следующем:
усиление цитотоксичности по отношению к клеткам с нарушенными параметрами просто, ускорении клиренса и переваривания метаболитов и продуктов разрушения опухолевых клеток, в исчезновении токсикоза у больных;
угнетении роста опухоли и подавлении процесса метастезирования;
усилении эффективности и снижении токсичности антибластомных препаратов;
сокращении до минимума или отмены переливания крови или кровезаменителей;
отмене необходимости длительного применения противоболевых фармацевтических препаратов;
увеличении продолжительности жизни больных онкологическими заболеваниями;
резком снижении частоты вторичных бактериальных инфекций, связанных с условно-патогенными микробами.

Использование: медицинская микробиология и может быть использовано для получения вакцин, обладающей иммуногенными свойствами против различных форм новообразований, лейкозов, рака молочной железы, яичников, желудка. Сущность изобретения: получен штамм бактерий Corynebacterium Krestovikova - Troitskaga ГИСК N 227, используемый для приготовления иммуностимулятора. Штамм нереактогенный, с малой аллергогенностью, стимулирующий неспецифическую резистентность и иммунореактивность организма.

ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIUM KRESTOVNIKOVA - TROITSKAYA, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА.

Штамм бактерий Corynebacterium Krestovnikova - Troitskaya ГИСК N 227, используемый для приготовления иммуностимулятора.