ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЙ ПРЕПАРАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2016 года по МПК A61K39/40 A61K39/02 A61P35/00 A61P37/02 

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и фармакологии и может быть использовано для профилактики и терапии злокачественных новообразований.

Изобретение касается средства профилактики и терапии онкологических заболеваний, конкретно, нового антигенного препарата, приготовленного на основе культуральных штаммов бледной трепонемы, а также способов его приготовления и применения.

К настоящему времени собран большой материал, подтверждающий эффективность применения препаратов на основе иммуностимуляторов микробного происхождения при опухолевых заболеваниях с различной локализацией и на разных стадиях процесса. Хотя подобные средства не проявляют прямого противоопухолевого и антиметастатического действия, они обладают способностью усиливать противоопухолевый иммунитет путем повышения и/или восстановления эффекторного механизма, опосредованного через презентативную функцию макрофагов, регуляцию синтеза интерлейкина-1 (ИЛ-1), фактора некроза опухоли (ФИО), интерлейкина-2 (ИЛ-2), естественных киллеров (NK-клеток) и др., а также могут модифицировать другие биологические аспекты взаимоотношений организма-носителя и опухоли.

Одним из наиболее ранних примеров использования микробных факторов для терапии опухолей человека являются препараты, полученные на основе простейшего -Trypanosoma cruzi: «Круцин» - в России и «Трипанозома» - во Франции (Клюева, Н.Г. Биотерапия злокачественных опухолей / Н.Г.Клюева // Вестник АМН СССР. - 1946. - №2-3. - С. 44-53.; Каллинникова, В.Д. Противоопухолевые свойства жгутикового простейшего Trypanosoma cruzi. - Тула: Гриф и К., 2004. - 280 с.). Однако, несмотря на многочисленные сообщения о положительных результатах, они не получили широкого признания.

Известно использование в клинической онкологии для лечения рака мочевого пузыря противотуберкулезной вакцины БЦЖ. Однако механизм противоопухолевого действия вакцины так до конца и не изучен. Недостатком является высокая реактогенность и сенсибилизирующие свойства вакцины при многократном введении (Иммунология и аллергология / под ред. А.А. Воробьева, А.С. Быкова, А.В. Карауловой. М: Практическая медицина, 2006. - 287 с.).

Предложено использование для биотерапии рака вакцины на основе цитоплазматических мембран L-форм бактерий, в частности, возбудителя бруцеллеза. При этом низко-дифференцированные структурно микробные клетки в конечной L3-форме трансформации рассматриваются как «реликтовые», имеющие высокую степень сходства с клетками злокачественных новообразований, что определяет возможность приготовления на их основе вакцинного противоопухолевого препарата (Казпатент №13980, RU 2409376, 13.08.2002). Однако приводимые данные о положительных результатах лечения и профилактики касаются только доброкачественных заболеваний, а убедительных сведений о применении данной вакцины у больных со злокачественными новообразованиями не представлено.

Известно о применении в комплексной терапии онкологических больных раком тела матки и легкого живой туляремийной вакцины (RU 2092186 C1 10.10.1997). Недостатком данного способа является то, что введение живой культуры патогенного микроорганизма в условиях закономерно возникающих у онкологических больных нарушений иммунитета, при одновременном использовании цитостатических препаратов, способствует реализации присущих вакцине осложнений и побочных эффектов, связанных с накоплением и размножением в организме туляремийного микроба: сенсибилизации, высокой реактогенности, развитию инфекционного процесса. Данные осложнения в некоторых случаях требуют проведения антибактериальной терапии. Кроме того, исходя из патогенеза туляремии, иммуностимуляции подвергаются, преимущественно, специфические гуморальные звенья иммунной системы, которым принадлежит лишь вспомогательное значение в противоопухолевом иммунитете.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является иммуностимулирующий препарат (вакцина), который представляет собой культуру штамма бактерий Corynebacterium krestovnicova-troitskaya. Данная вакцина не обладает специфическим лечебным воздействием на рост опухолей, а влияет на них опосредованно через стимуляцию иммунной системы (гуморальной и клеточной) путем восстановления естественной резистентности к опухолевому процессу (RU 2027755 C1 27.01.1995). Культура штамма накапливается на плотной питательной среде, суспендируется и полученная взвесь используется для введения онкологическим больным. Недостатком данного метода терапии является то, что используется культура живых бактерий, выделенных от человека; в отношении данного штамма нет достаточного объема убедительных данных о его безопасности. Кроме того, представленная в патенте схема приготовления вакцины нетехнологична, невоспроизводима и не позволяет получить стандартный по свойствам препарат.

В заявляемом изобретении предложено использование культуральных бледных трепонем в качестве основы для разработки средства профилактики и терапии опухолей.

Возбудитель сифилиса (бледная трепонема) был выделен в 1905 году (Schaudin et Hoffman), относится к виду Treponema pallidum. За длительный период его изучения путем заражения восприимчивых лабораторных животных (приматы, кролики) были получены и охарактеризованы несколько штаммов тканевых патогенных для человека бледных трепонем (Никольса, Будапештский, 1 Иркутский, VIII и XII ЦКВИ и другие), последующее сохранение штаммов проводилось путем регулярных перевивок на лабораторных животных. Многочисленные попытки выращивания бледной трепонемы на питательных средах в анаэробных условиях привели к получению таких штаммов культуральных бледных трепонем, как «ставропольские», «казанские», Рейтера, Труффи, Мульцера («Мюнхенский») и др. Наибольшее количество культуральных штаммов бледных трепонем в нашей стране выделили В.М. Аристовский и P.P. Гельтцер [Овчинников, Н.М. Экспериментальный сифилис / Н.М.Овчинников. - М.: Медгиз, 1955. - 387 с.]. «Казанский» (V) и «ставропольские» (VII, VIII, IX) штаммы наряду со штаммом Рейтера в настоящее время применяют для приготовления антигенов для серодиагностики. Установлено, что культуральные трепонемы отличаются от тканевых по своим морфологическим, биохимическим и патогенным свойствам. Однако особенно значимо то, что антигенные свойства их очень близки к патогенным вариантам возбудителя сифилиса. При этом ни один из штаммов культуральных трепонем не обладает патогенностью для человека. Кроме того, их можно выращивать в лабораторных условиях в необходимых количествах на искусственных питательных средах и сохранять в течение продолжительного периода времени путем регулярных пересевов.

Известные из уровня техники публикации в своем большинстве описывают использование антигенных препаратов, приготовленных из культуральных трепонем, для серодиагностики сифилиса. В частности из уровня техники известен способ приготовления ультраозвученного антигена из культуральных штаммов трепонем, на основе которого готовят диагностикум для постановки реакции связывания комплемента. Биомассу бледных трепонем выращивают на искусственной тиогликолевой среде из полного набора штаммов трех антигенных групп с последующей дезинтеграцией клеток ультразвуком, центрифугированием, отделением неразрушенных трепонем, центрифугированием надосадочной жидкости, выделением осадка стенок трепонем и супернатанта. (Патент РФ 2141339 «Способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем». Пожарская В.О. Опубл. 20.11.99 г. Бюл. 32).

Также известно использование антигенов клеточных стенок (КСТ) культуральных бледных трепонем в качестве иммуногена для получения контрольной сыворотки для диагностики сифилиса в реакции связывания комплемента (Патент РФ 2185856 «Способ получения контрольной сыворотки для диагностики сифилиса». Пожарская В.О., Гуртовой Е.А., Ермолов А.В. Опубл. 27.07.2002 Бюл. 21,). Способ осуществляется путем интратестикулярного заражения кроликов весом 3,0-3,5 кг патогенным штаммом Никольса, через 7-8 суток после заражения животных дважды с интервалом 7-8 суток иммунизируют внутривенно клеточными структурами культуральных бледных трепонем (КСТ-антигеном) из культуральных бледных трепонем с последующим обескровливанием животных через 30 сут после заражения. Способ позволяет повысить средние титры антикардиолипиновых антител в РСК с разведения 1:15 до 1:40 в крови обескровленных животных.

Таким образом, из уровня техники не выявлено источников информации, в которых было бы представлено использование культуральных бледных трепонем в качестве основы для создания средств для профилактики и терапии онкологических заболеваний.

Задача изобретения заключается в разработке эффективного и безопасного иммуностимулирующего препарата для профилактики и терапии злокачественных новообразований на основе культуральных бледных трепонем.

Техническим результатом является расширение арсенала иммуностимулирующих средств, обладающих иммуностимулирующим действием и противоопухолевой активностью.

Заявляемый препарат характеризуется биотехнологичностью, эффективностью и стандартностью свойств (с получением готовых препаратов, соответствующих требуемым показателям качества). При этом биотехнологичность является важным требованием, которое предъявляется к штаммам, пригодным для конструирования вакцинных препаратов, обеспечивающем возможность получения достаточных объемов микробной массы и длительного поддержания в стабильном состоянии в лабораторных условиях.

Поставленная задача решается тем, что иммуномодулирующий препарат для профилактики или терапии онкологических заболеваний в качестве основы содержит возбудитель сифилиса - бледную трепонему. В различных вариантах использования изобретения в качестве основы могут быть использованы нативные или инактивированные корпускулярные антигены, приготовленные из культуральных штаммов бледной трепонемы. Наилучший результат достигается при использовании смеси инактивированных корпускулярных антигенов не менее трех лабораторных штаммов трепонем, при этом штаммы могут быть взяты в равных пропорциях, что не является обязательным. Оптимальным является вариант, при котором используемые штаммы относятся к трем антигенным группам возбудителя. Возможен вариант использования препарата, в котором в качестве основы использованы инактивированные корпускулярные антигены штаммов трепонем, сорбированные на гидроокиси алюминия.

Препарат, предназначенный для терапии онкологических заболеваний, может содержать смесь инактивированных нагреванием и консервированных добавлением фенола микробов культуральных штаммов бледной трепонемы (например, 1 мл препарата содержит 0,5±0,1 мг микробного антигена в пересчете на сухое вещество и 2,5±0,2 мг фенола). Препарат, предназначенный для профилактики онкологических заболеваний, может содержать смесь инактивированных нагреванием, адсорбированных на гидроокиси алюминия и консервированных добавлением фенола микробов культуральных штаммов бледной трепонемы (например, 1 мл препарата содержит 28,0±1,0 мг корпускулярного микробного антигена в пересчете на сухое вещество, 2,5±0,2 мг фенола и 1,3±0,1 мг ионов алюминия).

Поставленная задача решается тем, что способ получения заявляемого препарата включает приготовление посевного материала штаммов культуральных трепонем, получение биомассы микробов в жидкой питательной среде, концентрирование полученных микробных суспензий, термоинактивацию концентрированных нативных суспензий, их консервацию и очистку.

Возможны различные варианты осуществления перечисленных этапов способа. При этом в одном из вариантов при приготовлении посевного материала микробы культуральных трепонем выращивают в мясо-пептонном бульоне с кусочками говяжьей печени в анаэробных условиях при температуре (37±1)°C в течение 7-10 сут; для получения биомассы микробов выращивание культуральных трепонем осуществляют в коммерческой жидкой питательной среде «Бульон Омата для трепонем и фузобактерий» с добавлением 10% коммерческой сыворотки крупного рогатого скота, либо в искусственной тиоглико-левой среде (например, изготовленной по патенту на изобретение РФ №2141339) в анаэробных условиях при температуре (37±1)°C в течение 7-10 сут в шейкере-инкубаторе при частоте оборотов платформы 120±10 оборотов·мин^-1; концентрирование полученной микробной суспензии культуральных трепонем можно осуществлять путем естественного осаждения в течение 22-24 ч и частичного декантирования надосадочной жидкости (от 60 до 80% от общего объема культуральной жидкости), например, с помощью вакуумной системы; термоинактивацию концентрированной нативной суспензии культуральных трепонем осуществляют однократно при температуре (58±2)°C в течение 60 мин.; консервацию термоинактивированных концентрированных суспензий культуральных трепонем осуществляют посредством добавления фенола до конечной концентрации 0,5±0,1%; очистку осуществляют, например, путем фильтрации и последующей отмывки физиологическим раствором хлористого натрия с добавлением фенола до конечной концентрации 0,5±0,1%, которую производят трехкратно.

Из очищенной суспензии готовят корпускулярные антигены культуральных трепонем с требуемой концентрацией (например, не менее 25 ед. экстинции, что соответствует 35 мг·мл^-1 микробного антигена в пересчете на сухое вещество). В частном варианте осуществления изобретения готовят корпускулярные антигены не мене трех культуральных штаммов трепонем, относящихся к разным антигенным группам, с последующим их смешиванием (отдельные штаммы трепонем смешивают, например, в равных пропорциях в разных комбинациях таким образом, чтобы в конечном поливалентном препарате были представлены, по крайней мере, по одному штамму, относящемуся к одной из трех антигенных групп.) При приготовлении препарата смешивают расчетные количества корпускулярного антигена и фенолизированного физиологического раствора хлористого натрия (0,25±0,02% фенола) таким образом, чтобы конечный препарат для терапии содержал требуемое количество микробного антигена (например, 0,5±0,1 мг·мл^-1) в пересчете на сухое вещество. В другом варианте осуществления способа смешивают расчетные количества поливалентного корпускулярного антигена, фенолизированного физиологического раствора хлористого натрия (0,25±0,02% фенола) и гидроокиси алюминия (1,3±0,1 мг·мл^-1 ионов алюминия) таким образом, чтобы конечный препарат для профилактики содержал требуемое количество микробного антигена (например, 28,0±1,0 мг·мл^-1) в пересчете на сухое вещество.

Поставленная задача решается тем, что способ модуляции противоопухолевого иммунитета включает парентеральное введение заявляемого препарата по п. 1 (например, в виде подкожной инъекции) в фармацевтически приемлемом количестве. Способ профилактики или терапии онкологических заболеваний также включает парентеральное введение препарата в фармацевтически приемлемом количестве. При этом при профилактике онкологического заболевания одновременно с введением заявляемого препарата возможно дополнительное введение препарата, где в качестве активно действующего вещества использована коммерческая вакцина бруцеллезная живая сухая в дозе, рекомендованной инструкцией по применению препарата.

В примерах осуществления изобретения на моделях различных опухолей для лечения онкологического заболевания препарат вводили подкожно в дозе 0,125 мг антигена в пересчете на сухое вещество пятикратно с интервалом между первыми четырьмя инъекциями 1 сутки, 14 суток - между четвертой и пятой, для профилактики онкологического заболевания вводили сорбированный на гидроокиси алюминия препарат в дозе 7,0 мг антигена в пересчете на сухое вещество однократно подкожно.

Проведенный анализ информации научной, патентной литературы и ресурсов сети Интернет, выявил, что наиболее полный набор штаммов культуральных бледных трепонем имеется в наличии в филиале НПО «Микроген» «Аллерген» (г. Ставрополь), где они используются при производстве трепонемного ультраозвученного диагностикума для реакции связывания комплемента.

В качестве питательных сред для выращивания культуральных бледных трепонем могут быть использованы любые известные из уровня техники составы. Для поддержания культур обычно используют традиционный мясо-пептонный бульон с добавлением кусочков вареной печени. Для накопления биомассы может использоваться коммерческий «Бульон Омата для трепонем и фузобактерий» (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Индия), а также искусственная тиогликолевая среда, представленная в материалах Патента на изобретение РФ №2141339. Для обеспечения анаэробных условий в среды вносят тиогликолевую кислоту или ее соли, для стимуляции роста возбудителя добавляется нативная сыворотка лошадей, кроликов, крупного рогатого скота. Оптимальный рост возбудителя на жидких питательных средах можно наблюдать на 7-10 сутки выращивания при температуре 37±1°C.

Проведенные исследования эффективности заявляемого препарата на моделях перевиваемых опухолей, таких как меланома, саркома и др., которые обычно используются при оценке эффективности разрабатываемых противоопухолевых препаратов (Трещалина, Е.М Противоопухолевая активность веществ природного происхождения / Е.М. Трещалина. - М.:, 2005 г.; Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под. ред. Р.У. Хабриева. - М.: «Медицина», 2005 г. - 832 с.), показали положительное действие трепонемного антигена на рост и метастазирование злокачественных новообразований. Полученные результаты обусловлены опосредованными через иммунную систему механизмами, имеющими общие неспецифические черты при реализации противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета, который в данном случае развивается по Th1-зависимому типу с активацией цитотоксических Т-лимфоцитов, макрофагов, синтезом большого количества разнообразных медиаторов иммунокомпетентными клетками, что также иллюстрируется приведенными ниже примерами. Некоторые данные проведенных исследований представлены в примерах ниже, которые не ограничивают настоящее изобретение, а лишь демонстрируют достигаемый технический результат.

В рамках данного изобретения были решены задачи по созданию противоопухолевого препарата на основе возбудителя сифилиса посредством использования культуральных штаммов бледной трепонемы.

По итогам проведенных исследований следует отметить, что наилучший эффект от реализации изобретения достигается при использовании в качестве основы препарата не менее 3 культуральных штаммов бледных трепонем, относящихся к известным 3 антигенным группам в различных комбинациях (/Зебницкая Л.В. - Вести. дерматол., 1955, N 4, с. 4-27). В частности, к первой группе относится IX «ставропольский» штамм; ко второй - II, VIII «ставропольские» штаммы; к третьей - V «казанский» штамм и штамм Рейтера. В одном из вариантов реализации изобретения был приготовлен поливалентный корпускулярный антигена на основе концентрированных нативных суспензий культуральных штаммов трепонем, в другом - на основе термоинактивированных суспензий культуральных штаммов трепонем. В результате проведенных экспериментов была показана эффективность от применения заявляемого препарата в качестве иммуностимулирующего препарата для профилактики и терапии опухолей.

Таким образом, в основе изобретения лежит получение и использование нового препарата микробного происхождения, приготовленного из нативных или инактивированных клеток культуральных штаммов бледных трепонем. Средство характеризуется воспроизводимой технологией получения, безопасностью, высокой иммуностимулирующей и противоопухолевой эффективностью в экспериментах на лабораторных животных и моделях перевиваемых опухолей.

Разработанная технология приготовления препарата основана на определенной последовательности действий (этапов) с использованием на отдельных этапах питательных сред, условий выращивания, концентрирования, щадящей инактивации, очистки микробных взвесей и обеспечивает получение необходимых количеств полноценного по иммунобиологическим свойствам антигенного препарата (таблица 1).

Использование комплекса показателей контроля на всех стадиях приготовления препарата (таблица 2) обеспечивает воспроизводимость и стандартность технологии получения препарата. Применение корпускулярного трепонемного антигена в качестве иммуностимулирующего средства при парентеральном введении лабораторным животным характеризуется высоким иммуностимулирующим действием на показатели клеточного звена иммунитета и выраженным противоопухолевым эффектом при использовании на моделях перевиваемых опухолей.

Таким образом, созданный новый препарат микробного происхождения на основе культуральных бледных трепонем и его использование для профилактики и терапии опухолей являются новыми и отвечающими критерию «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения поливалентного корпускулярного инактивированного антигена на основе культуральных штаммов трепонем

Из уровня техники известно деление бледных трепонем на 3 антигенные группы. Для получения поливалентного корпускулярного инактивированного антигенного препарата использовали штаммы трепонем №№Рейтера, V (3 антигенная группа), VII, VIII (2 антигенная группа), IX (1 антигенная группа) в различных комбинациях. Основные стадии приготовления антигена, контрольные точки и требования к показателям качества представлены в таблицах 1, 2.

Согласно указанной схеме было приготовлено 4 серии антигенного препарата, отличающиеся комбинацией входящих в их состав штаммов. Характеристики качества представлены в таблице 3.

Таким образом, использование в составе представленных образцов препаратов не менее 3 культуральных штаммов бледных трепонем, относящихся к известным 3 антигенным группам в различных комбинациях, обеспечивает антигенную полноценность, представительность и гомологичность препарата в отношении патогенных тканевых трепонем.

Пример 2. Способ получения поливалентного корпускулярного нативного антигена на основе лабораторных штаммов трепонем

Для получения поливалентного корпускулярного нативного антигенного препарата использовали штаммы трепонем №№Рейтера, V (3 антигенная группа), VII, VIII (2 антигенная группа), IX (1 антигенная группа) в различных комбинациях. Основные стадии приготовления антигена, контрольные точки и требования к показателям качества представлены в таблицах 4, 5.

Согласно указанной схеме было приготовлено 4 серии антигенного препарата, отличающиеся комбинацией входящих в их состав штаммов. Характеристики качества представлены в таблице 6.

Пример 3. Характеристики неспецифического иммуностимулирующего эффекта поливалентного антигена на основе штаммов культуральных трепонем на показатели Т-клеточного звена иммунитета

Оценку неспецифического иммуностимулирующего действия поливалентного корпускулярного трепонемного антигена на показатели клеточного звена иммунитета оценивали на нелинейных белых мышах. Препарат вводили животным подкожно в разовой дозе 0,125 мг антигена в пересчете на сухое вещество пятикратно с интервалом 1 сутки. Показатели стимуляции иммунитета оценивали на 14 и 21 сутки после введения.

В опытах изучали стимулирующее влияние препарата на относительное (доля) и абсолютное содержание (клетки·мл^-1) популяций (субпопуляций) лимфоцитов, которым принадлежит основная роль в реализации противоопухолевого иммунитета. С целью дифференциации отдельных пулов лимфоцитов использовались традиционные CD - маркеры. Количественную оценку субпопуляций лимфоцитов проводили с использованием проточного цитофлуориметра Navios («Beckman Coulter», США).

При оценке динамики показателей клеточного иммунитета для наглядности представления информации использовали коэффициент стимуляции, который рассчитывали по формуле:

где:

А₁ - абсолютное (относительное) фоновое значение показателя;

A₂ - абсолютное (относительное) значение показателя после введения препарата.

Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 7 и 8.

В течение всего периода наблюдения отмечается стимуляция показателей противоопухолевого клеточного иммунитета, выражающаяся в повышении содержания NK-клеток, Т-лимфоцитов хелперов и Т-лимфоцитов цитотоксических, повышенном уровне продукции INF-γ Т-лимфоцитами хелперами и Т-лимфоцитами супрессорами. Максимальная стимуляция указанных показателей наблюдается на 14 сутки с момента начала терапии, к 21 суткам наблюдения их величины снижаются, тем не менее, превышают фоновые.

Пример 4. Терапия заявляемым средством линейных мышей с привитым опухолевым штаммом меланомы В16.

Для оценки терапевтической эффективности препарата в отношении солидных опухолей (мезенхимального происхождения) проводили эксперимент на перевиваемом подкожно мышином опухолевом штамме меланомы В16. В опыте использовали мышей линии C57BL/6 обоего пола. Опухоль трансплантировали путем подкожного введения в область передней конечности ближе к позвоночнику в объеме 0,2 мл (200 тыс.клеток) на мышь. Одной группе животных с лечебными целями вводили поливалентный антиген на основе культуральных трепонем подкожно через 1, 3, 5, 7, 14 суток после имплантации опухоли в разовой дозе 0,125 мг. Второй группе животных вводили сорбированный на гидроокиси алюминия препарат подкожно в разовой дозе 0,625 мг однократно через 1 сут после имплантации опухоли.

В качестве контрольной группы использовали мышей той же линии без введения исследуемого препарата.

Противоопухолевый эффект оценивали по следующим общепринятым показателям: торможение роста опухоли (ТРО), увеличение продолжительности жизни (УПЖ), индекс торможения метастазирования (ИТМ).

Расчет индекса торможения роста опухоли проводили следующим образом. Начиная с 12-14 суток с момента имплантации опухоли, проводили 3 измерения опухолевых узлов - через каждые 5-7 дней (в зависимости от интенсивности опухолевого роста). Для этого с помощью штангенциркуля определяли два размера (длину и ширину) опухолевых узлов. Объем (V, мм³) вычисляли по формуле:

где:

а - длина опухолевого узла, мм,

b - ширина опухолевого узла, мм.

Индекс торможения роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле:

где:

ТРО - индекс торможения роста опухоли, %;

V_{контроля} - средний объем опухоли в контрольной группе, мм³;

V_опыта - средний объем опухоли в опытной группе, мм³.

Индекс увеличения продолжительности жизни (УПЖ) рассчитывали по формуле:

где:

СПЖ_опыта - средняя продолжительность жизни животных в опытной группе, дни;

СПЖ_{контроля} - средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе, дни.

Изучение влияния на метастатическую активность опухоли осуществляли в соответствии с приведенной ниже методикой. В каждой опытной группе умерщвляли по 5 мышей в день гибели первой мыши в контрольной группе. Грудную полость животных вскрывали, извлекали легкие и подсчитывали количество метастазов. Вычисляли частоту метастазирования опухоли в процентах по отношению числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе. Подсчитывали среднее количество метастазов у одного животного в группе. Индекс торможения метастазирования (ИТМ) вычисляли по формуле:

где:

A₁ - частота метастазирования в контрольной группе;

А₂ - частота метастазирования в опытной группе;

В₁ - среднее количество метастазов у животных в контрольной группе;

В₂ - среднее количество метастазов у животных в опытной группе.

Результаты эксперимента приведены в таблице 9.

Как следует из представленных в таблице данных, на все сроки наблюдения отмечается торможение роста опухоли (максимальное значение индекса ТРО зарегистрировано на 23 сутки наблюдения и составило 40,2%) и значительное снижение уровня метастазирования (значение ИТМ составило 68,1%) у животных, получавших препарат на основе культуральных штаммов трепонем по вышеуказанной схеме. Достоверного влияния на продолжительность жизни леченных животных по сравнению с нелеченными особями в проведенном эксперименте отмечено не было.

При оценке эффективности использования по лечебной схеме препарата, сорбированного на геле гидроокиси алюминия, установлена значительная противоопухолевая эффективность в отношении модели меланомы В16, превышающая таковую при использовании несорбированного препарата. Максимальные значения индекса ТРО составили соответственно 61,7 и 40,2%. Кроме увеличения значений показателей ТРО и ИТМ в данном эксперименте наблюдалось достоверное увеличение продолжительности жизни животных (показатель УПЖ составил 45,3% против минус 5,0% при пятикратном введении несорбированного препарата).

Пример 5. Терапия заявляемым средством мышей с привитым опухолевым штаммом саркомы Sa37.

Для оценки терапевтической эффективности препарата в отношении солидных опухолей (мезенхимального происхождения) проводили эксперимент на перевиваемом подкожно мышином опухолевом штамме саркомы Sa37. В опыте использовали мышей линии Balb/c обоего пола. Опухоль трансплантировали путем подкожного введения в область передней конечности ближе к позвоночнику в объеме 0,2 мл (300 тыс.клеток) на мышь. Одной группе животных с лечебными целями вводили поливалентный корпускулярный трепонемный антиген подкожно через 1, 3, 5, 7, 14 суток после имплантации опухоли в разовой дозе 0,125 мг. Второй группе животных вводили сорбированный на гидроокиси алюминия препарат подкожно в разовой дозе 0,625 мг однократно через 1 сут после имплантации опухоли.

В качестве контрольной группы использовали мышей той же линии без введения исследуемого препарата.

Противоопухолевый эффект оценивали по следующим общепринятым показателям: торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ). Порядок расчета показателей приведен в примере 4.

Данные, представленные в таблице 10, свидетельствуют о том, что на 12-е и 17-е сутки наблюдения в группе животных, получавших пятикратную инъекцию препарата, отмечалось торможение роста опухоли (значения индекса ТРО составляли соответственно 10,9% и 26,8%).

Результаты оценки эффективности использования препарата, сорбированного на геле гидроокиси алюминия, по лечебной схеме не показали увеличения противоопухолевой активности в сравнении с несорбированным препаратом.

Пример 6. Сочетанное применение заявляемого средства и коммерческой вакцины бруцеллезной живой сухой для профилактики опухолевого роста в эксперименте на мышах с использованием перевиваемых штаммов меланомы В16 и саркомы Sa37.

Для оценки противоопухолевой эффективности препарата на основе культуральных штаммов бледной трепонемы в комбинации с вакциной бруцеллезной живой проводили эксперимент на перевиваемых подкожно мышиных опухолевых штаммах меланомы В16 и саркомы Sa37. В опыте использовали мышей линии C57BL/6 обоего пола (для меланомы) и Ba1b/c обоего пола (для саркомы). Опухоль трансплантировали путем подкожного введения в область передней конечности ближе к позвоночнику в объеме 0,2 мл (200 тыс.опухолевых клеток меланомы штамма В16 и 300 тыс.клеток саркомы штамма Sa37) на мышь. Схемы и дозы комбинированного введения препаратов представлены в таблицах 11 и 12. Суспензии клеток перевиваемых опухолевых штаммов имплантировали через 45 суток после последнего введения вакцин.

В качестве контрольной группы использовали мышей той же линии без введения исследуемого препарата.

Противоопухолевый эффект оценивали по следующим общепринятым показателям: торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ). Порядок расчета показателей приведен в примере 4.

Анализ данных, представленных в таблицах 11 и 12 (имплантация опухолевого материала через 45 суток после последнего введения комбинации препаратов), в сравнении с результатами изучения эффективности моноторапии заявляемого средства (таблицы 9, 10) показал повышение противоопухолевой эффективности при сочетанном применении поливалентного трепонемного антигена и бруцеллезной вакцины.

Этот эффект в большей степени проявился на модели меланомы В16, в меньшей - на модели саркомы Sa37. Максимальное значение показателя ТРО составляло для меланомы В16 - 73,6%, для саркомы Sa37 - 47,0%, значение индекса УПЖ для меланомы В16 - 13,5%, для саркомы Sa37 - 29,2%. Максимальное значение показателя ИТМ для меланомы В16 составило 56,7%. Наибольший эффект был достигнут на обеих моделях при использовании схемы сочетанного применения, при которой первоначально животным вводили поливалентный корпускулярный инактивированный сорбированный на гидроокиси алюминия антигенный препарат на основе трепонем в дозе 7,0 мг, а через 3 суток - вакцину бруцеллезную живую в дозе согласно инструкции при подкожном введении, что составляет 400 млн клеток на мышь.

Данная схема сочетанного применения может быть использована для профилактики (торможения) опухолевого роста в группах повышенного риска.

Пример 7. Терапия заявляемым средством мышей с привитым опухолевым штаммом карциномы легкого Льюиса LLC.

Для оценки терапевтической эффективности препарата в отношении карциномы легкого Льюиса использовали самцов мышей линии C57BL/6. Опухоль трансплантировали путем подкожного введения в область передней конечности ближе к позвоночнику в объеме 0,5 мл (1 млн клеток) на мышь. Одной группе животных с лечебными целями вводили поливалентный корпускулярный антиген на основе культуральных трепонем подкожно через 1, 3, 5, 7, 14 суток после имплантации опухоли в разовой дозе 0,125 мг. Второй группе животных вводили сорбированный на гидроокиси алюминия препарат подкожно в разовой дозе 0,625 мг однократно через 1 сут после имплантации опухоли.

В качестве контрольной группы использовали мышей той же линии с имплантированной опухолью без введения исследуемого препарата.

Противоопухолевый эффект оценивали по следующим общепринятым показателям: торможение роста опухоли (ТРО), увеличение продолжительности жизни (УПЖ) и индекс торможения метастазирования (ИТМ). Порядок расчета показателей приведен в примере 4.

Данные, представленные в таблице 13, свидетельствуют о том, что при пятикратном введении поливалентного антигена происходит некоторое (около 13%) торможение роста опухоли, и не отмечается существенного увеличения продолжительности жизни животных.

Результаты оценки эффективности использования сорбированного на геле гидроокиси алюминия препарата по лечебной схеме свидетельствуют о том, что данный способ лечения ведет к торможению роста опухоли в пределах 18-24% и снижению метастазирования (ИТМ=17,6%).

Пример 8. Терапия заявляемым средством кроликов с привитым опухолевым штаммом карциномы Браун-Пирс

Для оценки профилактической эффективности препарата в отношении карциномы Браун-Пирс использовали самцов кроликов породы «Великан».

Опухоль трансплантировали путем инъекции опухолевой ткани в яичко. Для этого опухолевый узел бережно гомогенизировали в стерильной ступке с небольшим количеством стерильного 0,9% физиологического раствора хлорида натрия и фильтровали через 2 слоя марли для удаления крупных кусков опухолевой ткани. Для инъекций брали 0,5 мл 20% взвеси опухолевых клеток.

Животным вводили сорбированный на гидроокиси алюминия поливалентный корпускулярный инактивированный антиген на основе культуральных трепонем подкожно в дозе 28 мг антигена в пересчете на сухое вещество однократно. Через месяц после введения препарата проводили интратестикулярную прививку карциномы Браун-Пирс. В качестве контрольной группы использовали кроликов той же породы с имплантированной опухолью без введения исследуемого препарата.

Противоопухолевый эффект оценивали по следующим общепринятым показателям: торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ). Порядок расчета показателей приведен в примере 4.

Данные, представленные в таблице 14, свидетельствуют о том, что при введении исследуемого препарата, сорбированного на геле гидроокиси алюминия, по профилактической схеме наблюдается торможения роста карциномы Браун-Пирс на 30 и 60 сутки эксперимента в пределах 20-25%, при этом продолжительность жизни экспериментальных животных возрастает на 30%.

Таким образом, заявляемый препарат обладает неспецифическим иммуностимулирующим действием с преимущественным влиянием на звенья Т-клеточного иммунитета. Препарат при терапевтическом применении эффективно воздействует на опухоли различного гистогенеза

Пример 9. Характеристики неспецифического иммуностимулирующего эффекта поливалентного антигена на основе штаммов культуральных трепонем в отношении гетероло-гичного патогена Salmonella typhimurium

Оценку напряженности гетерологичного иммунитета на фоне иммунизации экспериментальными образцами вакцины проводили на белых мышах обоего пола массой 18,0-20,0 г.

Животных иммунизировали сорбированным на гидроокиси алюминия препаратом подкожно в объеме 0,5 мл двукратно с интервалом в 14 сут в дозе 3,5 мг корпускулярного микробного антигена в пересчете на сухое вещество. В иммунизированной и контрольной группе в последующем оценивали величину показателя LD₅₀ для культуры штамма Salmonella typhimurium с использованием метода подгрупп.

С этой целью через 60 сут после введения препарата мышей заражали подкожно кратными дозами микробной суспензии, приготовленной из агаровой культуры штамма S. typhimurium. Всего в опыте использовали 5 доз. Каждой дозой заражали по 6 интактных и по 6 иммунизированных животных. За мышами наблюдали в течение 14 сут и регистрировали наличие и сроки гибели животных по группам. Специфичность гибели подтверждали бактериологическим методом.

По окончании наблюдения для контрольной и иммунизированной группы рассчитывали величину показателя LD₅₀ по методу Кербера в модификации Ашмарина.

где:

LD₅₀ - доза, вызывающая гибель 50% животных;

δ - логарифм кратности разведения;

D_max - максимальная заражающая доза;

Li - отношение числа павших по специфической причине животных при заражении данной дозой к общему числу животных, которым эта доза была введена;

ΣLi - сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.

Коэффициент защиты - отношение величины показателя LD50 иммунизированных животных к величине показателя LD₅₀ интактных животных.

Полученные данные указывают на наличие у препарата существенного неспецифического иммуностимулирующего действия. Величина показателя LD₅₀ культуры S. typhimurium (гетерологичного патогена) в опытной группе (14,45·10⁶ живых микробов) в 6,75 раза превышала аналогичный показатель для контрольной группы животных (2,14·10⁶ живых микробов).

Следует также отметить, что у вакцинированных животных отмечалось удлинение сроков жизни при инфицировании максимальной из использованных доз возбудителя сальмонеллеза по сравнению с аналогичной группой интактных животных: среднее время жизни после заражения у вакцинированных животных (группа 5/1) составило 6,5 сут, у интактных (группа 5/2) - 3,5 сут.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что заявляемый препарат обладает неспецифическим иммуностимулирующим действием с преимущественным влиянием на звенья Т-клеточного иммунитета. Препарат при терапевтическом применении эффективно воздействует на опухоли различного гистогенеза.

Изобретение относится к фармакологии, а именно к препарату для стимуляции противоопухолевого иммунитета или терапии онкологических заболеваний. Препарат для стимуляции противоопухолевого иммунитета или терапии онкологических заболеваний, характеризующийся тем, что в качестве основного компонента содержит смесь нативных или инактивированных корпускулярных антигенов, полученных, по меньшей мере, из трех культуральных штаммов бледной трепонемы, относящихся к разным антигенным группам возбудителя. Способ получения препарата включает приготовление посевного материала, по меньшей мере, из трех штаммов культуральных трепонем, получение биомассы микробов в жидкой питательной среде, концентрирование полученных микробных суспензий, термоинактивацию концентрированных нативных суспензий, их консервацию, очистку и последующее их смешение. Способ стимуляции противоопухолевого иммунитета включает парентеральное введение препарата в фармацевтически приемлемом количестве. Способ терапии онкологических заболеваний включает парентеральное введение препарата в фармацевтически приемлемом количестве. Вышеописанное изобретение позволяет расширить арсенал иммуномодулирующих средств с противоопухолевой активностью. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 ил., 14 табл., 9 пр.

1. Препарат для стимуляции противоопухолевого иммунитета или терапии онкологических заболеваний, характеризующийся тем, что в качестве основного компонента содержит смесь нативных или инактивированных корпускулярных антигенов, полученных, по меньшей мере, из трех культуральных штаммов бледной трепонемы, относящихся к разным антигенным группам возбудителя.

2. Препарат по п. 1, характеризующийся тем, что штаммы бледной трепонемы относятся к трем антигенным группам возбудителя.

3. Препарат по п. 1, характеризующийся тем, что к первой антигенной группе штамма бледной трепонемы относится № - IX, к второй - VII, VIII, к третьей - Рейтера, V.

4. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что использованы инактивированные корпускулярные антигены штаммов трепонем, сорбированные на гидроокиси алюминия.

5. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что он содержит смесь инактивированных нагреванием и консервированных добавлением фенола микробов культуральных штаммов бледной трепонемы.

6. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что он содержит смесь инактивированных нагреванием, адсорбированных на гидроокиси алюминия и консервированных добавлением фенола микробов культуральных штаммов бледной трепонемы.

7. Способ получения препарата по любому из пп. 1 - 6, включающий приготовление посевного материала, по меньшей мере, из трех штаммов культуральных трепонем, получение биомассы микробов в жидкой питательной среде, концентрирование полученных микробных суспензий, термоинактивацию концентрированных нативных суспензий, их консервацию, очистку и последующее их смешение.

8. Способ по п.7, характеризующийся тем, что при приготовлении посевного материала микробы культуральных трепонем выращивают в мясо-пептонном бульоне с кусочками говяжьей печени в анаэробных условиях при температуре 37±1°С в течение 7-10 сут.

9. Способ по п.7, характеризующийся тем, что для получения биомассы микробов выращивание культуральных трепонем осуществляют в коммерческой жидкой питательной среде «Бульон Омата для трепонем и фузобактерий» с добавлением 10 % коммерческой сыворотки крупного рогатого скота в анаэробных условиях при температуре 37±1°С в течение 7-10 сут в шейкере-инкубаторе при частоте оборотов платформы 120±10 об.·мин^-1.

10. Способ по п.7, характеризующийся тем, что концентрирование полученной микробной суспензии культуральных трепонем осуществляют путем естественного осаждения в течение 22-24 ч и частичного декантирования надосадочной жидкости от 60 до 80 % от общего объема культуральной жидкости с помощью вакуумной системы.

11. Способ по п.7, характеризующийся тем, что термоинактивацию концентрированной нативной суспензии культуральных трепонем осуществляют однократно при температуре 58±2°С в течение 60 мин.

12. Способ по п.7, характеризующийся тем, что консервацию термоинактивированных концентрированных суспензий культуральных трепонем осуществляют посредством добавления фенола до конечной концентрации 0,5±0,1 %.

13. Способ по п.7, характеризующийся тем, что очистку термоинактивированных концентрированных суспензий культуральных трепонем осуществляют путем фильтрации и последующей отмывки фенолизированным физиологическим раствором хлористого натрия 0,5±0,1 % фенола.

14. Способ по п.13, характеризующийся тем, что отмывку физиологическим раствором хлористого натрия с добавлением фенола до конечной концентрации 0,5±0,1 % производят трехкратно.

15. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что смешивают расчетные количества поливалентного корпускулярного антигена и фенолизированного физиологического раствора хлористого натрия с содержанием 0,25±0,02 % фенола таким образом, чтобы конечный препарат для терапии содержал от 0,4 до 0,6 микробного антигена в пересчете на сухое вещество.

16. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что смешивают расчетные количества поливалентного корпускулярного антигена, фенолизированного физиологического раствора хлористого натрия с содержанием 0,25±0,02 % фенола и гидроокиси алюминия с содержанием 1,3±0,1 мг·мл^-1 ионов алюминия таким образом, чтобы конечный препарат для стимуляции противоопухолевого иммунитета содержал от 27,0 до 29,0 микробного антигена в пересчете на сухое вещество.

17. Способ стимуляции противоопухолевого иммунитета, включающий парентеральное введение препарата по п.1 в фармацевтически приемлемом количестве.

18. Способ терапии онкологических заболеваний, включающий парентеральное введение препарата по п.1 в фармацевтически приемлемом количестве.

19. Способ по п.18, характеризующийся тем, что при терапии онкологического заболевания одновременно с введением препарата по п.1 дополнительно осуществляют введение препарата, где в качестве активно действующего вещества использована коммерческая вакцина бруцеллезная живая сухая в дозе, рекомендованной инструкцией по применению препарата.