1,3-БИС(ИЗОБУТИЛТИОЭТИЛ)-5-ГИДРОКСИ-6-МЕТИЛУРАЦИЛ, ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1995 года по МПК C07D239/62 A61K31/505 

Изобретение относится к органической химии, конкретно к новому химическому соединению 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-гидрокси-6-метилурацилу формулы
проявляющему иммунотропную активность.

Указанное соединение, его свойства в литературе не описаны.

Аналогом по строению и назначению является 6-метилурацил [1]

Недостаток 6-метилурацила в том, что он имеет низкое супрессирующее влияние на клеточное звено иммунитета.

Новое соединение 1,3-бис-(изобутилтиоэтил)-5-гидрокси-6-метилурацил (11-89-4) характеризуется выраженной иммунотропной активностью, его получают в условиях известного способа [1], согласно которому 5-гидрокси-6-метилурацил в водно-спиртовой среде в присутствии едкого кали обрабатывают трехкратным мольным количеством β-хлорэтилизобутилсульфида при комнатной температуре с последующим нагреванием реакционной смеси до 90^оС и перемешиванием при этой температуре 2 ч, следя за окончанием реакции по изменению рН (рН должна быть нейтральной или слабокислой, рН = 6-7). После отгонки непрореагировавшего β-хлорэтилизобутилсульфида получают 49,7 г (44,2%) светло-желтой густой жидкости с n_D²⁰ 1,5350, которая при охлаждении кристаллизуется. Этот остаток представляет собой 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-гидрокси-6-метилурацил.

Найдено,%: C 54,76; H 8,50; N 7,19; S 18,00.

C₁₇H₃₀N₂O₃S₂.

Вычислено,%: C 54,51; H 8,07; N 7,48; S 17,12; O 12,82.

ИК-спектр (ν, см^-1): 720, 760, 840 (RCH₂S): 980, 1010 (ω_C=C): 1060, 1080, 1120, 1140, 1260, 1340 (ν_C-N); 1640, 1680 (ν_C=C, N-C = 0); 2880 ( ν^SRCH₂S); 2380, 2940 (ν_C=C, ν^a_CH); 3200 (2 ν _CN); 3350 (OH).

ЯМР ¹Н (δ, м.д., CDCl₃): 0,988 (д, J = 6,6; 12H^4д); 1,62 (сикст. J = 4, 2Н^2г); 2,22 (с, 3Н⁶); 2,32 (м, 4,Н^2в); 2,68 (сикст. J = 3, 4H^2б); 3,98 (сикст. J = 4,5; 4Н^2а); 7,36 (ушир. сингл. (1Н^и);

Иммунные свойства и острая токсичность предлагаемого соединения изучена на кафедре совместной лаборатории Института органической химии Уральского отделения РАН и кафедре фармакологии Башкирского медицинского института им. 15-летия ВЛКСМ.

Исследования проводили на белых беспородных мышах массой 15-17,0 г, полученных из питомника лабораторных животных "Рапполово" АМН СССР.

Острая токсичность определялась на беспородных мышах обоего пола при однократном внутрибрюшинном введении. Вводились дозы от 50 до 1600 мг/кг. После введения токсических доз через 5-10 мин у животных наблюдалась вялость, вытягивание конечностей, снижение подвижности. Смерть наступала от остановки дыхания.

Параметры токсичности определяли по методу Кербера. При внутрибрюшинном введении ЛД₅₀ соединения составляла 1000+97,0 мг/кг. На основании классификации токсичности веществ при введении под кожу и в брюшную полость [2,3] данное соединение относится к малотоксичным.

Влияние соединения 11-89-4 на иммунную систему изучали на моделях гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и антителообразования.

Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) к 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) воспроизводили сенсибилизацией животных нанесением на кожу живота 25 мкл 0,5% -ного раствора ДНФБ в смеси ацетона с оливковым маслом (4:1) [4]. Через 5 сут после сенсибилизации на предварительно измеренные микрометром уши капали по 20 мкл 0,25%-ного раствора ДНФБ. Реакцию оценивали по отеку уха через 24 ч после нанесения разрешающей дозы ДНФБ. Соединение вводили в дозе 100 мг/кг (1/10 ЛД₅₀) в течение четырех суток, начиная с первого дня после сенсибилизации. Структурный аналог соединения 6-метилурацил вводили в общепринятой дозе (200 мг/кг) по той же схеме.

Значение прироста толщины ушей в опытной группе существенно ниже (P < 0,01), чем в контрольной, что позволяет говорить о наличии у соединения 11-89-4 супрессирующего влияния на клеточное звено иммунитета в отличие от структурного аналога 6-метилурацила, который достоверно стимулировал реакцию ГЗТ к ДНФБ, т.к. соединение 11-89-4 проявилo иммуносупрессивное влияние на клеточное звено иммунитета, для выявления преимущества заявленного соединения перед известным, нами проведено дополнительное исследование на модели реакции ГЗТ в сравнении с широко применяемым иммуносупрессором - гидрокортизоном [5,6].

Реакцию ГЗТ проводили аналогично [4], только вместо 6-метилурацила был взят иммуносупрессор - гидрокортизон, который вводили по той же схеме. Полученные данные приведены в табл.2.

Таким образом, соединение 11-89-4 обладает выраженным супрессирующим эффектом на клеточное звено иммунитета (на модели ГЗТ), причем его действие аналогично супрессирующим свойствам известного иммунодепрессанта - гидрокортизона. В отличие от гидрокортизона соединение 11-89-4 является менее токсичным (ЛД₅₀ = =1000+97,0 мг/кг по Керберу при внутрибрюшинном введении ЛД₅₀ гидрокортизона 454,9+57,0 при внутрибрюшинном введении).

Влияние соединения на гуморальное звено иммунного ответа определяли по методу N.K. Jerne, A.A. Nordin [7] в модификации A.J. Cunningham [8]. Мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением нормиммунной дозы эритроцитов барана за 4 полных суток до опыта. Взвесью спленоцитов эритроцитов барана и комплемента морской свинки в соотношении 1:1:2 заполняли камеры. После инкубации в термостате при 37^оС в течение 1,5 ч подсчитывали визуально число зон гемолиза, соответствующее количеству антителообразующих клеток (АОК). Производили пересчет АОК на 10⁶спленоцитов. Соединения вводили на +1 до +4 сутки после инкубации в дозе 1/10 ЛД₅₀ (100 мг/кг). В качестве препарата сравнения использовали метилурацил в дозе 200 мг/кг в том же режиме введения.

Соединение 11-89-4 существенно стимулирует образование АОК, являясь более активным (p < 0,05), чем известный препарат 6-метилурацил, не влияя на массу селезенки и не увеличивая, в отличие от 6-метилурацила, количества спленоцитов.

Таким образом, малотоксичное соединение 11-89-4 характеризуется выраженной иммунотропной активностью, подавляя клеточное звено иммунитета и стимулируя антителогенез.

П р и м е р 1. 1,3-Бис(изобутилтиоэтил)-5-гидрокси-6-метилурацил. В трехгорлую колбу емкостью 1000 мл, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником, капельной воронкой, заливают 250 мл воды, приливают 61 г (82%-ного едкого кали) (0,9 моля), 250 мл спирта и присыпают 42,9 г (0,3 моля) 5-гидрокси-6-метилурацила при перемешивании. К полученному гомогенному раствору прибавляют по каплям 152,5 г (1 моль) β-хлорэтилизобутилсульфида в течение 1 ч, реакционную смесь нагревают до 90^оС и при этой температуре перемешивают 2 ч, следя за окончанием реакции по изменению рН (вначале рН = 8-9, а после окончания реакции рН = 6-7), дополнительно перемешивают 2 ч при этой температуре. Реакционную смесь охлаждают, отделяют верхний слой, водный экстрагируют эфиром (3 х 100 мл), соединяют с основным слоем, отгоняют эфир на роторном испарителе ИР-1М, остаток сушат бензолом, и получают 140,6 г (95%) полукристаллической массы, из которой отфильтровывают кристаллы, сушат на фильтре, а затем переносят в колбу Кляйзена и при температуре бани 140-200^оС/3 мм рт.ст., отгоняют непрореагировавший β-хлорэтилизобутилсульфид (9,9 г), а остаток охлаждают и получают 49,7 г (44,2%) светло-желтой густой жидкости с n_D²⁰ 1,5350, которая при охлаждении кристаллизуется. Этот остаток представляет собой 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-гидрокси-6-метилурацил.

Найдено,%: C 54,76; H 8,50; N 7,19; S 18,00.

C₁₇H₃₀N₂O₃S₂.

Вычислено,%: C 54,51; H 8,07; N 7,48; S 17,12; O 12,83.

ИК-спектр (ν , см^-1): 720, 760, 840 (RCH₂S); 980, 1010 (ω_C=C); 1060, 1080, 1120, 1140, 1260, 1340 (ν_C-N); 1640, 1680 (ν_C=O, N-C = 0 ); 2880 (ν^SRCH₂S); 2880, 2940 ( ν_C=C, ν^a_CH); 3200 (2 ν_CN); 3350 (ν_OH).

ЯМР ¹Н (δ, м.д., CDCl₃): 0,988 (д, J = 6,6; 12Н^4д); 1,62 (сикст. J = 4,0; 2Н^2г); 2,22 (с, 3Н^с6); 2,32 (м, 4Н^2в); 2,68 (сикст., J = 3,0^2б); 2,98 (сикст. J = 4,5; 4Н^2а); 7,36 (ушир. сингл.1Н^и).

Биологическая активность 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-гидрокси-6-метилурацила (11-89-4) иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 2. В качестве модели клеточного иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у беспородных мышей. Реакцию ГЗТ воспроизводили обычным способом, сенсибилизируя мышей нанесением на выстриженный живот 25 мкл 0,5%-ного раствора ДНФБ в смеси ацетона с оливковым маслом (4:1) через 5 сут после сенсибилизации на предварительно измеренные микрометром уши капали по 20 мкл 0,25%-ного раствора ДНФБ. Реакцию оценивали по отеку уха через 24 ч после нанесения разрешающей дозы ДНФБ. Соединение вводили в дозе 100 мг/кг (1/10 ЛД₅₀) в течение четырех суток, начиная с первого дня после сенсибилизации. Структурный аналог соединения 6-метилурацил вводили в общепринятой дозе (200 мг/кг) по той же схеме (см.табл.1).

Прирост толщины ушей для 11-89-4 в % составляет 26,0+7,1, для 6-метилурацила - 60,2+4,8.

П р и м е р 3. В условиях примера 2, сопоставление проведено с известным иммуносупрессором - гидрокортизоном, который вводили в дозе 50 мг/кг по той же схеме (см.табл.2). Прирост толщины ушей для 11-89-4 в % составляет 13,0+3,0 для гидрокортизона - 26,0+7.

П р и м е р 4. Влияние соединения 11-89-4 на гуморальное звено иммунного ответа определяли по методу N.K. Jerne, A.A. Nordin (1963) [7], в модификации A.J. Cunninghnam (1965) [8]. Мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением нормиммунной дозы эритроцитов барана и комплемента морской свинки в соотношении 1: 1: 2 заполняли камеры. После инкубации в термостате при температуре 37^оС в течение 1,5 ч подсчитывали визуально число зон гемолиза, соответствующее количеству антителообразующих клеток (АОК). Производили пересчет АОК на 10⁶спленоцитов. Соединение вводили на +1 до +4 сутки после иммунизации в дозе 1/10 ЛД₅₀ (100 мг/кг). В качестве препарата сравнения использовали 6-метилурацил в дозе 200 мг/кг в том же режиме введения.

Соединение 11-89-4 существенно стимулирует образование АОК, являясь более активным (p < 0,05), чем известный препарат 6-метилурацил, не влияя на массу селезенки и не увеличивая, в отличие от 6-метилурацила, количества спленоцитов.

П р и м е р 5. Острую токсичность определяли на беспородных мышах обоего пола при однократном внутрибрюшинном введении. Вводились дозы от 50 до 1600 мг/кг. После введения токсических доз через 5-10 мин у животных наблюдалась вялость, вытягивание конечностей, снижение подвижности. Смерть наступала от остановки дыхания.

Параметры токсичности определяли по методу Кербера. При внутрибрюшинном введении ЛД₅₀ соединения составила 1000+97,0 мг/кг. На основании классификации токсичности веществ при введении под кожу и в брюшную полость данное соединение относится к малотоксичным [4].

Соединение 11-89-4 [1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-гидрокси-6-метилурацил], являясь малотоксичным, характеризуется выраженной иммунотропной активностью, подавляя клеточное звено иммунитета и стимулируя антителогенез.

Использование: в качестве иммунотропного средства в медицине. Сущность изобретения: продукт - 1,3-бис(3-изобутилтиоэтил)-5-гидрокси-6-метилурацил, БФ C₁₇H₃₀N₂O₃S₂ выход 44,2%. Реагент 1: 5-гидрокси-6-метилурацил. Реагент 2: β -хлорэтилизобутилсульфид. Условия процесса: в водно-спиртовом растворе в присутствии щелочи при нагревании. 3 табл.

1,3-БИС(ИЗОБУТИЛТИОЭТИЛ)-5-ГИДРОКСИ-6-МЕТИЛУРАЦИЛ, ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ.

1,3-Бис(изобутилтиоэтил)-5-гидрокси-6-метилурацил формулы

обладающий иммунотропной активностью.