1,3-БИС(ИЗОБУТИЛТИОЭТИЛ)-5-ИЗОБУТИЛТИОЭТИЛОКСИ-6-МЕТИЛ-УРАЦИЛ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ ИММУНОТРОПНУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 1995 года по МПК C07D239/62 A61K31/505 

Изобретение относится к области органической химии, конкретно к новому химическому соединению - 1,3-бис(изо- бутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилурацилу формулы
проявляющему выраженную иммунотропную активность.

Указанное соединение, его свойства в литературе не описаны.

Аналогом по строению и назначению является 6-метилурацил, способ которого описан в литературе.

Недостаток 6-метилурацила в том, что он слабо стимулирует гуморальный иммунитет.

Новое соединение - 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилура-цил (11-89-3), номер регистрационного удостоверения 9374189 от 11 августа 1989 г., характеризуется выраженной иммунотропной активностью.

1,3-Бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилти- оэтокси-6-метилурацил получают в условиях известного способа, согласно которому 5-гидрокси-6-метилурацил в водно-спиртовой среде в присутствии едкого кали обрабатывают трех-, четырехкратным мольным количеством β-хлорэтилизобутилсульфидом при комнатной температуре с последующим нагреванием реакционной смеси до 90^оС и перемешиванием при этой температуре до нейтральной или слабокислой среды (2-3 ч). Выход 42,18% 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилурацила, представляющего собой светло-желтую жидкость с n_D²⁰ 1,5320, хорошо растворимую в хлороформе, бензоле, эфире, ацетоне, спирте и нерастворимую в воде.

Найдено,%: C 56,00; H 8,84; N 5,70; S 20. 44.

C₂₃H₄₂N₂O₃S₃
Вычислено,%: C 56,29; H 8,63; N 5,75; S 19,60; O 9,78.

ИК спектр (ν, см^-1): 740 (RCH₂S); 1000 (ω_C=C,RCH=CHR) 1090, 1120 (ν_C-O-C); 1240 (); 1090, 1120, 1140, 1240, 1340 (ν_C-N); 1380, 1390 (гем. ); 1440 (); 1650, 1700 (ν_C=O,-N-C=O); 2880 (); 2930 (); 3200 (ν_C-N).

ЯМР¹Н (δ, м.д., CDCl₃): 0,99 (д, J = 6,64; 18H^6д); 1,8 (м, 3Н^3г); 2,37 (с, 3Н⁶); 2,465 (д, J = 6,85; 4Н^2в); 2,5 (д, J = 5,93; 2Н^1в); 2,74 (сикст.) J = 6,57; 4Н^2б); 2,82 (сикст.) J = 7,14, 2^Нб); 4,0 (т, J = 7,96; 6H).

Иммунные свойства и острая токсичность предлагаемого соединения изучена на кафедре совместной лаборатории Института органической химии Уральского отделения РАН и кафедре фармакологии Башкирского медицинского института им. 15-летия ВКЛСМ.

Исследования проводили на белых беспородных мышах массой 18-20 г.

Острую токсичность определяли на беспородных мышах обоего пола при однократном внутрибрюшинном введении. Вводили дозы 50-1600 мг/кг. После введения токсических доз через 5-10 мин у животных наблюдалась вялость, вытягивание конечностей, снижение подвижности. Смерть наступала от остановки дыхания.

Параметры токсичности определяли по методу Кербера. При внутрибрюшинном введении ЛД₅₀ соединения составила 400±34,5. На основании классификации токсичности веществ при введении под кожу и брюшную полость данное соединение относится к малотоксичным.

Влияние соединения 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилура-цила на иммунную систему изучали на моделях гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) воспроизводили сенсибилизацией животных нанесением на кожу живота 25 мкл 0,5%-ного раствора ДФНБ в смеси ацетона с оливковым маслом (4:1). Через 5 сут после сенсибилизации на предварительно измеренные микрометром уши капали по 20 мкл 0,25% -ного раствора ДНФБ. Реакцию оценивали по отеку уха через 24 ч после нанесения разрешающей дозы ДФНБ. Соединение вводили в дозе 40 мг/кг (1/10 от ЛД₅₀) в течение 4 сут, начиная с первого дня после сенсибилизации. Структурный аналог соединения метилурацил вводили в общепринятой дозе (200 мг/кг).

Влияние соединения 11-89-3 на реакцию ГЗТ у мышей дано в табл.1.

Значение прироста толщины ушей в опытной и контрольной группах одинаковы, что позволяет говорить об отсутствии у соединения 11-89-3 супрессирующего влияния на клеточное звено иммунитета, в отличие от структурного аналога метилурацила, который достоверно стимулировал реакцию ГЗТ к ДНФБ.

Влияние соединения 11-89-3 на образование АОК в селезенках беспородных мышей-самцов приведены в табл.2.

Соединение 11-89-3 [1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилура-цил] существенно стимулирует образование АОК, являясь более активным (Р < 0,05) ( в 3 раза), чем известный препарат 6-метилурацил, не влияя на массу селезенки и не увеличивая, в отличие от 6-метилурацила, количества силеноцитов.

Так как соединение 11-89-3 увеличивает число АОК, авторами проведено дополнительное исследование влияния данного вещества на титры гемагглютининов. Титр гемагглютинации определяли по общепринятой методике.

Соединение 11-89-3 вводили в течение 4-х сут после иммунизации в дозе 1/10 от ЛД₅₀. В качестве препарата сравнения использовали 6-метилурацил в дозе 200 мг/кг в том же режиме введения (см.табл.3).

Соединение 11-89-3 [1,3-бис(изобутилэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилурацил] аналогично 6-метилурацилу увеличивает титры гемагглютининов, что еще раз подтверждает стимулирующее влияние вещества 11-89-3 на гуморальный иммунный ответ.

Таким образом, 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилурацил активнее в 3 раза (число АОКх10⁶ спленоцитов 2289,0±278,5), 6-метилурацила (число АОКх10⁶ спленоцитов 75,3±28,6), соединение не влияет на массу селезенки и не увеличивает, в отличие от 6-метилурацила, количества спленоцитов, а также аналогично 6-метилурацилу увеличивает титры гемагглютининов, что подтверждает стимулирующее влияние вещества 11-89-3 на гуморальный иммунный ответ.

Данное изобретение иллюстрируется примерами.

П р и м е р 1. 1,3-Бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилурацил.

В трехгорлую колбу емкостью 1000 мл, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником, капельной воронкой, заливают 250 мл воды, присыпают 61 г 82%-ного едкого кали (0,9 моль), приливают 250 мл спирта и присыпают 42,9 г (0,3 моль) 5-гидрокси-6-метилурацила при перемешивании. К полученному гомогенному раствору прибавляют по каплям 152,5 г (1,0 моль) β-хлорэтилизобутилсульфида в течение 1 ч, нагревают до 90^о и при этой температуре перемешивают 4 ч, следя за окончанием реакции по изменению рН (в начале рН 8-9, по окончании реакции рН 7-6). Реакционную смесь охлаждают, отделяют верхний слой, водный экстрагируют эфиром (3х100 мл), соединяют с основным слоем, отгоняют эфир на роторном испарителе ИР-1М, остаток сушат бензолом и получают 140,6 г (95%) полукристаллической массы, из которой отфильтровывают кристаллы, маточник переносят в колбу Кляйзена, отгоняют непрореагировавший β-хлорэтилизобутил- сульфид (20,02) при температуре бани 140-200^о/3 мм рт.ст. и получают 62,1 г (42,18%) 1,3-бис-изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэт- окси-6-метилурацила, представляющего собой светло-желтую жидкость с n_D²⁰ 1,5320, хорошо растворимую в хлороформе, бензоле, эфире, ацетоне, спирте и нерастворимую в воде.

Найдено,%: C 56,00; H 8,84; N 5,70; S 20,44.

C₂₃H₄₂N₂O₃S₃
Вычислено,%: C 56,29; H 8,63; N 5,75; S 19,6; O 9,78.

ИК-спектр (ν, см^-1): 740 (RCH₂S; 1000 (ω_C=C,RCH=CHR); 1090, 1120 (ν_C-O-C); 1240 (); 1090, 1120, 1140, 1240, 1340 (ν_C-N); 1380, 1390 (гем. ); 1440 (); 1650, 1700 (ν_C=O,N-C-O); 2880 (); 2930 (); 3200 (ν_C-N).

ЯМР¹Н (δ, м. д. CDCl₃); 0,99 (д, J = 6,64; 18Н^6д); 1,8 (м, 3H); 2,37 (с, 3Н^с6); 2,465 (д, J = 6,85; 4Н^2в); 2,5 (д, J = 5,93; 2Н^1в); 2,74 (сикст. , J = 6,57; 4Н^2б); 2,82 (сикст. J = 7,14; 2Н^б); 4,0 (т, J = 7,96; 6H).

Биологическая активность 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-мети- лурацил (11-89-3) иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 2. В качестве модели клеточного иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у беспородных мышей. Реакцию ГЗТ воспроизводили обычным способом, сенсибилизируя мышей нанесением на выстриженный живот 25 мкл 4,5%-ного раствора ДНФБ в смеси ацетона с оливковым маслом (4:1). Через 5 сут после сенсибилизации на предварительно измеренные микрометром уши капали по 20 мкл 0,25%-ного раствора ДНФБ. Реакцию оценивали по отеку уха через 24 ч после нанесения разрешающей дозы ДНФБ. Соединение вводили в дозе 40 мг/кг (1/10 ЛД₅₀) в течение 4 сут, начиная с первого дня после сенсибилизации. Структурный аналог соединения 6-метилурацил вводили в общепринятой дозе (200 мг/кг) по той же схеме.

1,3-Бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилти- оэтокси-6-метилурацил (11-89-3) не оказывает супрессивного действия на клеточное звено иммунного ответа. При дозе 40 мг/кг прирост толщины ушей (в %) составляет 46,5±5,5, в отличие от структурного аналога 6-метилурацила, который достоверно стимулирует реакцию ГЗТ к ДНФБ. Так, при дозе 200 мг/кг прирост толщины ушей (в %) составляет 60,2±4,8 (см.табл.1).

П р и м е р 3. В качестве модели первичного иммунного ответа использовали метод локального гемолиза в геле N.K.Jerne, A.A. Nordin в модификации A.J. Cunningham.

Беспородных мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением нормиммунной дозы (2х10⁸) эритроцитов барабана за 4 полных суток до опыта. Взвесью спленоцитов эритроцитов барабана и комплемента морской свинки в соотношении 1:1:2 заполняли камеры. После инкубации в термостате при температуре 37^оС в течение 1,5 часа подсчитывали визуально число зон гемолиза, соответствующее количеству антителообразующих клеток (АОК). Производили перерасчет АОК на 10⁶спленоцитов. Соединение вводили на +1-+4 сутки после иммунизации в дозе 1/10 ЛД₅₀ (140 мг/кг). Для 11-89-3 число АОКх10⁶ спленоцитов равно 2289,0±278,5. В качестве препарата сравнения использовали 6-метилурацил в дозе 200 мг/кг в том же режиме введения, число АОКх10⁶спленоцитов равно 751,3±28,6.

1,3-Бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутил- тиоэтокси-6-метилурацил оказывает в 3 раза выше, чем 6-метилурацил, стимулирующее влияние на антителогенез, не увеличивая массу селезенки и не увеличивая, в отличие от структурного аналога 6-метилурацила, количество спленоцитов (см.табл.2).

П р и м е р 4. Исследование влияния данного соединения 11-89-3 на титры гемагглютининов проводили по общепринятой методике.

Соединение 11-89-3 вводили в течение 4 сут после иммунизации в дозе 1/10 от ЛД₅₀. В качестве препарата сравнения использовали 6-метилурацил в дозе 200 мг/кг в том же режиме введения.

1,3-Бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилти- оэтокси-6-метилурацил аналогично 6-метилурацилу увеличивает титры гемагглютининов, что еще раз подтверждает стимулирующее влияние вещества 11-89-3 на гуморальный иммунный ответ (см. табл.3).

П р и м е р 5. Острая токсичность 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилурацила (11-89-3) определяли на беспородных мышах обоего пола массой 18-20 г при однократном внутрибрюшинном введении. Вводили дозы от 50 до 1600 мг/кг. После введения токсических доз через 5-10 мин у животных наблюдалось угнетение состояния, вытягивание конечностей, они были малоподвижны, смерть наступила от остановки дыхания.

Параметры токсичности определяли по методу Кербера. При внутрибрюшинном введении соединение 1,3-бис-(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилурацила ЛД₅₀составляет 400,0±34,5. На основании классификации токсичности веществ при введении под кожу и брюшную полость данное соединение относится к малотоксичным.

Таким образом, малотоксичное соединение 1,3-бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтокси-6-метилурацил характеризуется выраженной иммунотропной активностью, слабо подавляет клеточное звено иммунного ответа и стимулирует антителогенез в 3 раза лучше, чем аналог 6-метилурацил. Соединение 11-89-3 может найти практическое применение как иммуномодулятор, стимулирующий гуморальный иммунитет.

Использование: в качестве иммунотропного средства в медицине. Сущность изобретения: продукт - 1,3 - бис(изобутилтиоэтил) - 5 - изобутилтиоэтилокси - 6 метилурацил, бф C₂₃H₄₂N₂O₃S₃ , выход 42,18%. Реагент 1: 5 - гидрокси - 6 метилурацил. Реагент 2: β - хлорэтилизобутилсульфид. Условия процесса: в водно-спиртовом растворе в присутствии щелочи. 3 табл.

1,3-БИС(ИЗОБУТИЛТИОЭТИЛ)-5-ИЗОБУТИЛТИОЭТИЛОКСИ-6-МЕТИЛ-УРАЦИЛ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ ИММУНОТРОПНУЮ АКТИВНОСТЬ.

1,3 - Бис(изобутилтиоэтил)-5-изобутилтиоэтилокси-6-метилурацил формулы

проявляющий иммунотропную активность.