1,3-(2,6-ДИГИДРОКСИ-4-ТИАГЕПТАМЕТИЛЕН)-6-МЕТИЛУРАЦИЛ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ ИММУНОТРОПНУЮ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 1995 года по МПК C07D239/54 A61K31/505 C07D417/04 

Изобретение относится к органической химии, конкретно к новому химическому соединению, 1,3-(2,6-дигидрокси-4-тиагептаметилен)-6-метилурацилу формулы
проявляющему иммунотропную, противовоспалительную активность, который может найти применение в медицине.

Свойства указанного соединения в литературе не описаны. Наиболее близким аналогом по строению и назначению иммунотропной активности является 6-метилурацил формулы
синтез и свойства которого описаны в литературе [1]
Однако более активным иммуностимулятором из производных пиримидина является оксиметилурацил [2-4] который и взят в качестве эталона.

Недостаток оксиметилурацила в том, что он очень плохо растворим в воде (0,1%).

1,3-(2,6-Дигидрокси-4-тиагептаметилен) -6-метилурацил растворяется в воде 1% что превышает растворимость ОМУ в 10 раз и способствует более выраженной биодоступности.

Изыскано новое соединение 1,3-(2,6-дигидрокси-4-тиагептаметилен)-6-метилура- цил, который более эффективен в части проявления иммунотропной и противовоспалительной активности, а также более эффективной биодоступности.

Новое соединение получают путем обработки 6-метилурацила (I) ЭХГ (эпихлоргидрином) II в присутствии каталитического количества поташа в растворе ДМФА при 70-80^оС по методу [5] с последующим взаимодействием полученного 1,3-(2'-гидрокси-3'-хлорпропил)-6-метилурацила с Na₂S.

Cl
Исследования иммунотропной активности проводили на белых беспородных мышах массой 18-20 г, полученных из питомника лабораторных животных "Рапполово" АМН СССР.

Острая токсичность определялась на беспородных мышах обоего пола при однократном внутрибрюшинном введении. Параметры токсичности вычислялись по методу Кербера. Вводились дозы 50-1600 мг/кг. После введения токсических доз через 5-10 мин у животных наблюдалась вялость, вытягивание конечностей, снижение подвижности. Смерть наступала от остановки дыхания. ЛD₅₀ при внутрибрюшинном введении составляет 1650+112,5 мг/кг.

На основании классификации токсичности веществ при введении под кожу и брюшную полость [6-8] данное соединение относится к малотоксичным.

Влияние соединения 52-91-2 на иммунную систему изучали на моделях гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и первичного иммунного ответа эритроцитам барана (ЭБ) определение количества антителообразующих клеток селезенки мышей (АOК).

Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) к 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) воспроизводили сенсибилизацией животных, нанесением на кожу живота 25 мкл 0,5% -ного раствора ДНФБ в смеси ацетона с оливковым маслом [4:1] [6] Через 4 сут после сенсибилизации на интактные уши мышей наносили по 20 мкл 0,25% -ного раствора ДНФБ. Реакцию оценивали по отеку уха через 24 ч после нанесения разрешающей дозы ДНФБ. Соединение вводили в дозе 1/10 ЛD₅₀ (165 мг/кг) в течение 4 сут, начиная с первого дня после сенсибилизации. Структурный аналог соединения оксиметилурацил вводили в дозе 50 мг/кг по той же схеме. Полученные данные приведены в табл. 1.

Таким образом, 1,3-(2,6-дигидрокси-4-тиагептаметилен)-6-метилурацил обладает иммунотропными свойствами.

Противовоспалительное действие соединения 52-91-2 изучалось на двух моделях воспаления, вызванных каррагенином и формалином. Противовоспалительное действие данного соединения сравнивали с высоко эффективным и широко применяемым в медицине антифлогистином-ортофеном.

Влияние 1,3-(2,6-дигидрокси-4-тиагептаметилен)-6-метилурацила на первичный иммунный ответ изучали на белых беспородных мышах массой 18-20 г. Животных иммунизировали 5% взвесью эритроцитов барана по 0,5 мл внутрибрюшинно. На пятые сутки определяли число АОК в селезенке. Полученные результаты приведены в табл. 2.

В качестве референс-препарата использовали оксиметилурацил. Исследуемое соединение вводили животным per os (через рот) 4-х кратно, начиная вводить одновременно с иммунизацией в 1/10 ЛD₅₀.

Таким образом, 1,3-(2,6-дигидрокси-4-тиагептаметилен)-6-метилурацил обладает иммунотропными свойствами.

Противовоспалительное действие соединения 52-91-2 изучалось на двух моделях воспаления, вызванных каррагенином и формалином. Противовоспалительное действие данного соединения сравнивали с высокоэффективным и широко применяемым в медицине антифлогистиком-ортофеном.

Изучаемое соединение на модели воспаления, вызванной введением в апоневроз стопы 1%-ного раствора каррагенина в дозе 0,05 мл; соединение 52-91-2 вводилось в желудок в дозе 1/30 ч от ЛД₅₀ зф 1 ч до воспроизведения воспаления и через 1 и 2 ч после введения флогогена. О противовоспалительном действии изучаемого соединения судили по проценту увеличения отека по сравнению со здоровой лапкой и контролем. Данные приведены в табл. 3.

По данной модели воспаления соединение 52-91-2 в указанной дозе статистически значимо задерживает развитие воспалительного отека (р < 0,001) по сравнению с контролем) и аналогично ортофену.

В следующей серии на модели каррагенинового воспаления была вычислена эффективная доза (ЕD₅₀) для этого соединения.

Соединение 52-91-2 вводили животным в желудок в дозах 75,50 и 25 мг/кг, Соединение в дозах 50 и 25 мг/кг оказывает выраженное противовоспалительное действие, аналогичное эффекту ортофена. ЕD₅₀, вычисленное по Литчфильду и Уилконсону составляет 110 (83-145) мг/кг [9]
В следующих сериях изучалось действие данного соединения, взятое в дозе ED₅₀, на воспаление, вызванное каррагенином и формалином. Данные приведены в табл. 4.

Изучаемое соединение 52-91-2 на моделях воспаления, вызванного каррагенином, оказывает статистически значимое противовоспалительное действие.

На модели воспаления, вызванного формалином, данное соединение также задерживает развитие воспалительного отека аналогично оксиметилурацилу и ортофену.

Таким образом, 1,3-(2,6-дигидрокси-4-тиагептаметилен)-6-метилурацил является умеренно-опасным соединением и проявляющим выраженное противовоспалительное и иммунотропное действие.

П р и м е р 1. В трехгорлую колбу емкостью 500 мл, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником, термометpом помещают 40,0 г (0,18 моля) 1,4-бис(2'-гидрокси-3'-хлорпропил)-6-ме- тилурацила, приливают 200 мл ДМФА и жидкий раствор Na₂S˙9H₂O (64,7 г или 0,27 моля). Реакционная смесь покраснела, раствор гомогенный, рН щелочная. Реакционную смесь нагревают на масляной бане до 140-150^оС и при этой температуре перемешивают 8 ч и оставляют на ночь. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, из маточного раствора отгоняют ДМФА при температуре бани 80^оС/ 28-30 мм рт.ст на ротационном испарителе, охлаждают, обрабатывают остаток 28 мл воды, экстрагируют (100 мл х 5) бензолом, и (100 мл х 5) хлороформом и получают 1,7 г после отгонки растворителей.

Из водного слоя отгоняют воду, выпавшие соли отфильтровывают, приливают немного ДМФА (10 мл), выпавшую соль отфильтровывают, отгоняют ДМФА и получают 12,8 г (39,1%) 1,3(2,6-дигидрокси-4-тиагептиметилен)-6-метилурацила. По данным ТСХ продукт имеет одно пятно с Rf 0,66. (Растворитель ДМФА, проявитель УФ свет, элюент сп-ам 4:1).

Найдено, C 48,41; H 5,80; N 10,40; S 11,69.

С₁₁Н₁₆N₁O₄S,
Вычислено, C 48,52; H 5,92; N 10,29; S 11,77; O 23,50, мол.м. 272,3208.

Вычислено для С₁₁Н₁₆N₂S.˙H₂O, C 45,51; H 6,25; N 9,65; S 11,04; O 27,55.

П р и м е р 2. В качестве модели клеточного иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у беспородных мышей. Реакцию ГЗТ воспроизводили обычным способом, сенсибилизируя мышей нанесением на выстриженный живот 25 мкл 0,5% -ного раствора 2,4-динитрофторбензола (ДНФБ) в смеси ацетона с оливковым маслом (4:1).

Разрешающую дозу (20 мкл 0,25%-ного раствора ДНФБ) наносили на 4-е сутки после сенсибилизации на уши с предварительным изменением толщины. Соединения вводили внутрибрюшинно в дозе 1/10 ЛD₅₀ с +1 по +4 день. Всего 4 введения. Аналог по назначению оксиметилурацил вводили по той же схеме в дозе 50 мг/кг. Полученные данные приведены в табл. 1.

П р и м е р 3. В качестве модели первичного иммунного ответа использовали метод локального гемолиза в геле N.K.Jerne, A.A.Nordin (1963) [10] в модификации A.J.Cunningham (1965) [11]
Беспородных мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением норм иммунной дозы (2 х 10⁸) эритроцитов барана за 4 полных суток до эксперимента. Количество антителообразующих клеток (АОК) определяли по числу зон гемолиза в камерах. Производили пересчет АОК на 10⁶ спленоцитов.

П р и м е р 4. Изучение острой токсичности соединений.

Острая токсичность данных соединений изучалась на белых беспородных мышах обоего пола при однократном внутрибрюшинном способе введения.

Параметры токсичности вычислялись на десятый день наблюдения по методу Кербера. При внутрибрюшинном способе введения соединение 52-91-2 составляет ЛD₅₀1650 +112,5.

П р и м е р 5. Изучение противовоспалительной активности соединения на каррагениновой модели воспаления.

Противовоспалительная активность соединения 52-91-2 изучена у мышей по 6 в группе на модели острого отека, вызванного введением 0,05 мл 1%-ного водного раствора каррагенина субилантарно в заднюю лапку. За исходную величину принималась масса второй (здоровой) лапки.

Изученное соединение вводилось также животным в желудок через зонд в дозах 1/10 и 1/30 ЛD₅₀ за 1 ч до воспроизведения воспаления и через 1 и 2 ч после введения флогогена. Измерение нарастания отека лапок проводилось онкометрически через 4 часа после воспроизведения воспаления.

Изученное соединение задерживало нарастание воспалительного отека во все сроки измерения. Результаты онкометрического измерения представлены в табл. 3.

Противовоспалительная активность изученного соединения аналогична эффекту ортофена.

П р и м е р 6. Измерение ЕD₅₀ для соединения 52-91-2.

Соединение 52-91-2 вводили животным в желудок в дозах 75,50 и 25 мг/кг.

Данное соединение в дозах 50 и 25 мг/кг оказывает выраженное противовоспалительное действие, аналогичное эффекту ортофена. ED₅₀, вычисленное по Литчфильду и Уилкоксону составляет 110 (83+145) мг/кг.

П р и м е р 7. Аналогичен примеру 5 за исключением того, что соединение 52-91-2 бралось в дозе ED₅₀ на воспаление, вызванное каррагенином. Данные даны в табл. 4.

П р и м е р 8. Изучение противовоспалительной активности соединения 52-91-2 на формалиновой модели воспаления.

Опыты проводились на мышах (по 6 в группе).

Соединение в дозе 100 и 50 мг/кг вводилось животным в желудок через зонд за 2 часа до введения флогогена и через 1 и 2 часа после него. Острое воспаление задних лапок мышей воспроизводилось субилантарной инъекцией 0,1 мл 2% -ного водного раствора формалина.

Измерение объема лапок проводилось онкометрически через 6 ч и сутки после воспроизведения воспаления. За исходную величину принимался объем лапки до введения флогогена.

Соединение 52-91-2 задерживало нарастание воспалительного отека лапки во все сроки измерения. Результаты онкометрических измерений даны в табл. 4.

Изученное соединение обладает противовоспалительной активностью аналогично эффекту ортофена.

Использование: в медицине как проявляющее иммунотропную и противовоспалительную активность. Сущность изобретения: 1,3-(2,6-дигидрокси-4-тиагептаметилен)-6-метилурацил C₁₁H₁₆N₂O₄S мол. м. 272,32. Реагент1: 1,3-бис (2′ -гидрокси- 3′ -хлорпропил)-6-метилурацил, полученный путем обработки 6-метилурацила эпихлоргидрином в присутствии каталитического количества поташа в растворе ДМФА при 70 - 80°С. Реагент 2: Na₂S·9H₂O процесс ведут в ДМФА при 140 - 150°С в течение 8 ч. 4 табл.

1,3-(2,6-Дигидрокси-4-тиагептаметилен)-6-метилурацил формулы

проявляющий иммунотропную, противовоспалительную активность.