5-ГИДРОКСИ-3,6-ДИМЕТИЛУРАЦИЛ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ ИММУНОТРОПНУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 1995 года по МПК C07D239/60 A61K31/505 

Изобретение относится к области органической химии, конкретно к новому химическому соединению 5-гидрокси-3,6-диметилурацилу формулы
проявляющему иммунотропную активность.

Аналогом по строению и назначению является 6-метилурацил, который характеризуется недостаточно выраженной иммунотропной активностью.

Новое соединение 5-гидрокси-3,6-диметилурацил, более эффективно в части проявления иммунотропной активности, его получают в условиях известного способа путем обработки 6-метилурацил-5-аммонийсульфата в щелочной среде при 0-15^оС диметилсульфатом при соотношении компонентов 6-МУ-5АС NaOH ДМС 1:4:4 с последующим повышением температуры бани до кипения, перемешиванием при этой температуре 2 ч и выделением 5-гидрокси-3,6-диметилурацила фильтрацией кристаллов, выход составляет 52,5% чистота по данным ТСХ 100% 5-Гидрокси-3,6-диметилурацил с Тпл. > 270^оС мало растворимо в воде и не растворимо в органических растворителях.

Чистота 5-гидрокси-3,6-диметилурацила доказана методом ГЖХ кремнийпроизводного. 5-Гидрокси-3,6-диметилурацил не имеет примеси.

Найдено, C 45,95; H 5,10; N 17,80; Вычислено для C₆H₈N₂O₃, С 46,15; H 5,16; N 17,94; O 30,74. Мол. м. 156,14.

Положение заместителя доказано ИК-, УФ-спектрами.

Максимум поглощения УФ-спектра с изменением рН среды от 1 до 12 дает батохромный сдвиг на 34 нм.

рН 12 λ_max 313,50 λ_min 276,25
рН 7 λ_max 278,65 λ_min 245,15
рН 1 λ_max 278,65 λ_min 245,15 что характерно для урацилов, замещенных по третьему атому азота цикла.

ИК-спектр (ν, см^-1): 1096-1256 ( C- OH, V_C-N), 1376 (δ^S CH₃); 1604, 1680, 1720 (V_C=O); 1528 (V_CN + δ_NH); 3144 (V_NH); 3226, 3248 (2V_CN); 3328 (OH); 2856, 2880, 2928 (V_C=C, алиф. CH); 1460 (VCH₂, CH₃).

Исследования проводили на белых беспородных мышах массой 18-20 г, полученных из питомника лабораторных животных "Рапполово", АМН СССР.

Острая токсичность определялась на беспородных мышах обоего пола при однократном внутрибрюшинном введении. Вводились дозы от 50 до 1600 мг/кг. После введения токсических доз через 5-10 мин у животных наблюдалась вялость, вытягивание конечностей, снижение подвижности. Смерть наступала от остановки дыхания.

Параметры токсичности определяли по методу Кербера. Пpи внутрибрюшинном введении ЛД₅₀ составляет 1000,0 ± 27,6.

На основании классификации токсичности веществ при введении под кожу и в брюшную полость данное соединение относится к малотоксичным.

Влияние соединений на иммунную систему изучали на моделях гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и антителообразования.

Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) к 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) воспроизводили сенсибилизацией животных нанесением на кожу живота 25 мкл 0,5%-ного раствора ДНФБ в смеси ацетона с оливковым маслом (4:1). Через 4 сут после сенсибилизации на предварительно измеренные микрометром уши капали по 20 мкл 0,25%-ного раствора ДНФБ. Реакцию оценивали по отеку уха через 24 ч после нанесения разрешающей дозы ДНФБ. Соединение вводили в дозе 1/10 от ЛД₅₀ (100,0 мг/кг) в течение 4 сут, начиная с первого дня после сенсибилизации. Структурный аналог соединения 6-метилурацил вводят в общепринятой дозе (200 мг/кг) по той же схеме.

Значение прироста толщины ушей в опытной группе такое же, как в контрольной, что позволяет говорить об отсутствии супрессирующего влияния на клеточное звено иммунитета (табл. 1).

Влияние соединений на гуморальное звено иммунного ответа определяли по методу N.K. Jerne, A.A. Nordin в модификации A. Cunniughem.

Мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением нормиммунной дозы эритроцитов барана за 4 полных суток до ответа. Взвесью спленоцитов эритроцитов барана и комплемента морской свинки в соотношении 1:1:2 заполняли камеры. После инкубации в термостате при температуре 37^оС в течение 1,5 ч подсчитывали визуально число зон гемолиза, соответствующее количеству антителообразующих клеток (АОК). Производили пересчет АОКх10⁶спленоцитов. Соединения вводили на +1 до +4 сут после иммунизации в дозе 1/10 ЛД₅₀. В качестве препарата сравнения использовали 6-метилурацил в дозе 200 мг/кг в том же режиме введения.

Влияние соединений на образование АОК в селезенках беспородных мышей-самцов дано в табл. 2.

Соединение (12-89-1) 5-гидрокси-3,6-диметилурацил характеризуется выраженной иммунотропной активностью, стимулируя гуморальный имунный ответ значительно лучше, чем 6-метилурацил, не влияя на клеточное звено иммунитета.

П р и м е р 1. 5-Гидрокси-3,6-диметилурацил.

В трехгорлую колбу емкостью 1000 мл, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником, загружают 60 г (1,5 моль) едкого натра, заливают 400 мл воды, включают мешалку. Полученный раствор едкого натра охлаждают до 30-40^оС, а затем присыпают 119,6 г (0,5 моль) 6-метилурацил-5-аммонийсульфата и перемешивают до растворения. Реакционную смесь охлаждают до 6-15^оС и при этой температуре прибавляют по каплям в течение 1 ч 190,5 г (1,51 моль) или 143 мл диметилсульфата. После полного прибавления диметилсульфата температуру бани нагревают в течение 1-2 ч до 85-95^оС и при этой температуре перемешивают 2 ч, охлаждают, вливают 200 мл хлороформа, перемешивают 10 мин, кристаллы отфильтровывают на шоттовской воронке, промывают (4х50 мл) водой до нейтральной реакции, ацетоном (2х50 мл), подтягивают водоструйным насосом и получают 43,2 г (55,3%) 5-гидрокси-3,6-диметилурацила с Т.пл. > 270^оС, мало растворимого в воде, не растворимого в органических растворителях.

По данным ТСХ 5-гидрокси-3,6-диметилурацил не имеет примеси.

Найдено, C 45,95; H 5,10; N 17,80. Вычислено для C₆H₈N₂O₃, C 46,15; H 5,16; N 17,94; O 30,74; М.в. 156,14.

ИК-спектр (ν, см^-1): 1096-1256 ( C- OH, V_C-N); 1376 (δ^S CH₃); 1604, 1680, 1720 (V_C=O); 1528 (VCN + δ_NH); 3144 (V_NH); 3226, 3248 (2V_CN); 3328 (ОН); 2856, 2880, 2928 (V_C=C, V_алиф. CH); 1460 (VCH₂, CH₃).

Иммунотропная активность соединений иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 2. В качестве модели клеточного иммунитета исследовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у беспородных мышей. Реакцию ГЗТ воспроизводили обычным способом, сенсибилизируя мышей нанесением на выстриженный живот 25 мкл 0,5%-ного раствора 2,4-динитрофторбензола (ДНФБ) в смеси ацетона с оливковым маслом (4:1). Разрешающую дозу (20 мкл 0,25%-ного раствора ДНФБ) наносили на 4-е сут после сенсибилизации на уши с предварительно измеренной толщиной. Соединение 12-89-1 вводили внутрибрюшинно в дозе 1/10 от ЛД₅₀ с +1 по +4 день. Всего 4 введения. Структурный аналог соединения 6-метилурацил, взятый в качестве эталона, вводили в общепринятой дозе (200 мг/кг) по той же схеме. Полученные данные сведены в табл. 2.

П р и м е р 3. В качестве модели первичного иммунного ответа использовали метод локального гемолиза в геле N.K. Jerne, A.A. Nordin в модификации A. J. Cunningham.

Беспородных мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением нормиммунной дозы (2х10⁸) эритроцитов барана за 4 полных суток до эксперимента. Количество антителообразующих клеток (АОК) определяли по числу зон гемолиза в камерах. Производили пересчет АОК на 10⁶спленоцитов. Полученные данные сведены в табл. 2.

П р и м е р 4. Острую токсичность определяли на беспородных мышах обоего пола массой 18-20 г при однократном внутрибрюшинном введении в диапазоне доз от 50 до 1600 мг/кг. После введения токсических доз через 5-10 мин у животных наблюдалась вялость, снижение подвижности, токсические судороги.

Параметры токсичности определяли по методу Кербера. ЛД₅₀ соединения равно 1000,0 ± 122,6 мг/кг.

На основании классификации токсичности веществ при введении под кожу и в брюшную полость данное соединение относится к малотоксичным.

5-гидрокси-3,6-диметилурацил проявляет иммунотропную активность, стимулирует гуморальный иммунный ответ лучше, чем 6-метилурацил, не влияя на клеточное звено иммунитета.

Использование: в качестве иммунотропного средства. Сущность изобретения: 5-гидрокси-3,6-диметилурацил, БФ: C₆H₈N₂O_3, выход 55,3% , т.пл. >270°C. Реагент 1: 6-метилурацил-5-аммонийсульфат. Реагент 2: диметилсульфат. Процесс ведут в воде в присутствии щелочи. 2 табл.

5-Гидрокси-3,6-диметилурацил формулы

проявляющий иммунотропную активность.