ГЛУТАМАТ ЭТИЛОВОГО ЭФИРА АМБЕНА, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ ГРИППА СЕРОТИПОВ A И B Российский патент 1995 года по МПК C07C229/44 A61K31/195 

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к глутамату этилового эфира амбена
HOOC-CH₂-CH₂-COHCH₂-C₆H₄-COOC₂H₅
(I) обладающему противовирусным действием, что предполагает его применение в медицинской практике.

Заявляемое соединение в литературе не описано.

Глутамат амбена обладает антифибринолитическим, противовоспалительным и антимикробным действием /1/, глутаминовая кислота и ее соли используются в медицине при заболеваниях центральной нервной системы /2/.

В литературе описаны синтезы солей глутаминовой кислоты с некоторыми алифатическими, ароматическими и гетероциклическими аминами /3/. Известен глутамат гидразида амбена, обладающий противовирусной активностью /4/.

Наиболее близким структурным аналогом к заявляемому соединению является глутамат гидразида амбена, обладающий противовирусной активностью. В качестве базового объекта сравнения взят антивирусный препарат ремантадин, который обладает противовирусной активностью только в отношении вирусов гриппа серотипа А.

Общим признаком заявляемой соли и структурного аналога является наличие фрагментов п-аминометилбензойной и глутаминовой кислот. Существенным и определяющим отличием предлагаемого соединения является наличие этоксигруппы вместо гидразидной.

Цель изобретения - поиск новых производных амбена, обладающих более эффективным антивирусным действием в отношении вирусов гриппа серотипов А и В.

Поставленная цель достигается синтезом нового соединения формулы I, обладающего противовирусной активностью (см. табл. 1 и табл. 2), которое получают взаимодействием этилового эфира амбена с глутаминовой кислотой в водной среде.

П р и м е р 1. Получение глутамата этилового эфира амбена.

Смесь из 17,9 г (0,1 моль) этилового эфира амбена, 14,7 г (0,1 моль) глутаминовой кислоты и 100 мл воды кипятят 0,5 ч. К горячей реакционной массе добавляют 5 г активированного угля, раствор фильтруют горячим и охлаждают льдом.

Выпавший осадок соединения I отфильтровывают, промывают охлажденной водой, сушат. Получают 32 г (98%) белого кристаллического глутамата этилового эфира амбена с т.пл. 179-181^оС.

Найдено, %: C 54,99; H 6,49; N 8,26.

C₁₅H₂₂N₂O_6.
Вычислено, %: C 55,21; H 6,74; N 8,59.

В ИК-спектре глутамата этилового эфира амбена имеется полоса поглощения валентных колебаний группы H₃N 3070 см^-1 и поглощение аминокислотной полосы 11 1530 см^-1
В УФ-спектрах (в спирте) имеется максимум поглощения при λ 231 ± 2 нм (lgε 2,71), характерный для производных п-аминометилбензойной кислоты.

П р и м е р 2. Противовирусная активность глутамата этилового эфира амбена в отношении вируса гриппа серотипа А.

Исследование проведено на эталонном штамме вируса гриппа А(Гонконг/1/68(H3N2), который вызвал пандемию гриппа в 1968-1969 гг. и является родоначальником штаммов с антигенной формулой H3N2, актуальных и в настоящее время.

При определении у препарата противовирусного действия его в стерильных условиях растворяли в поддерживающей среде состава: NaCl 8,0 г; KCl 0,6 г; CaCl₂ 0,8 г; MgCl₂ 0,05 г; глюкоза 0,3 г; желатин 2,0 г; левомицитин 0,1 г; фенол-рот 25 мл 0,01%-ного раствора на 1 л дистиллированной воды. рН - 7,0 (среду стерилизуют при 115^оС в течение 30 мин). На среде, содержащей препарат (опыт) и не содержащей его (контроль) разводили аллантоисный вирус А/Гонконг/1/68(H3N2) до концентрации вируса порядка 100 ЭИД₅₀ мл и 10 контрольных, и 10 опытных проб инкубировали 24 ч при 36^оС с фрагментами хорионаллантоисных оболочек (ХАО) 12-14-дневных куриных эмбрионов. Затем культуральную жидкость из опытных и отдельно контрольных проб объединяли и концентрацию инфекционного вируса в них определяли титрованием десятикратных разведений на новой культуре ХАО. Концентрацию инфекционного вируса рассчитывали методом Кербера в модификации И.П.Ашмарина и выражали в ТИД₅₀.

Поскольку во всех экспериментах каждому опыту соответствовал свой контроль, т.е. имел место случай связанных выборок, то о статистической достоверности воздействия судили по непараметрическому критерию знаков (КЗ), что диктовало необходимость проведения не менее 5 опытов в серии. Одновременно исследовали прямое вирулицидное воздействие препарата на внеклеточный вирус и их влияние на чувствительность культуры к заражению после предварительной в течение 1 сут обработки ее с удалением препарата перед инфицированием клеток.

Результаты изучения противовирусного действия глутамата этилового эфира амбена на вирус гриппа А представлены в табл. 1.

Как следует из табл. 1 глутамат этилового эфира амбена проявляет антивирусную активность в отношении вируса гриппа А в концентрации 100 мкг/мл при репродукции вируса в его присутствии. При предварительной обработке ткани препаратом, а также изучении вирулицидного его действия в указанной концентрации статистически достоверного эффекта не обнаружено. Следовательно, противовирусное действие глутамата этилового эфира амбена в отношении возбудителя гриппа А связано с непосредственным его вмешательством в процесс вирусной репродукции. В меньшей дозе противовирусное действие препарата не проявлялось.

Глутамат гидразида амбена, выбранный в качестве референс-препарата, поскольку он близок по структуре и также обладает противогриппозным действием, тормозит репродукцию вируса гриппа А в дозе 3 мг/мл /4/, т.е. в 30 раз большей, чем эффективная концентрация испытуемого глутамата этилового эфира амбена. Заявляемое соединение проявляет антивирусное действие в отношении вируса гриппа серотипа А в 100 раз меньшей дозе, чем глутамат п-аминометилбензойной кислоты, обладающий антифибринолитической, противовоспалительной и антимикробной активностью /1/. Однако данные литературы свидетельствуют, что известный противогриппозный препарат ремантадин проявляет антивирусное действие в культуре ткани в отношении вирусов гриппа серотипа А при его концентрации 25-50 мкг/мл.

Таким образом, глутамат этилового эфира амбена в отношении вирусов гриппа серотипа А проявляет более выраженное антивирусное действие, чем глутамат гидразида амбена и глутамат амбена, но менее выраженное, чем ремантадин.

П р и м е р 3. Противовирусная активность этилового эфира амбена в отношении вируса гриппа серотипа В.

Исследование проведено на штамме В/Ленинград/17/86, выделенном в г. Ленинграде в 1986 г. При определении антивирусного действия глутамата этилового эфира амбена, его предварительно растворяли в спецсреде описанного в примере 2 состава. Затем определяли снижение инфекционной активности вируса В при титровании ее на фрагментах ХАО в присутствии препарата (опыт) по сравнению с инфекционной активностью вируса, определенной в отсутствие препарата (контроль). Одновременно исследовали прямое вирулицидное действие препарата на внеклеточный вирус и их влияние на чувствительность культуры к заражению после предварительной в течение 1 суток обработки ее с удалением препарата перед инфицированием клеток. Инкубация вируса гриппа В при заражении им фрагментов ХАО во всех вариантах опытов продолжалась 72 ч при 34^оС. Расчет ТИД₅₀ и статистическая обработка проводились, как в примере 2.

Результаты изучения противовирусного действия глутамата этилового эфира амбена на вирус гриппа В представлены в табл. 2.

Как следует из табл. 2, глутамат этилового эфира амбена проявляет антивирусную активность в отношении вируса гриппа В в концентрации 400 мкг/мл при репродукции вируса в его присутствии. При предварительной обработке ткани препаратом, а также изучении вирулицидного его действия статистически достоверного эффекта не обнаружено. Следовательно, противовирусное действие глутамата этилового эфира амбена в отношении возбудителя гриппа В связано с непосредственным его вмешательством в процесс вирусной репродукции. Референс-препарат - глутамат гидразида амбена проявляет противовирусное действие в отношении вируса гриппа В в дозе 5 мг/мл, т.е. в дозе в 7,5 раз большей, чем эффективная концентрация испытуемого глутамата этилового эфира амбена. Глутамат этилового эфира амбена проявляет антивирусное действие в отношении вируса гриппа серотипа В в 25 раз меньшей дозе, чем глутамат амбена /1/.

По литературным данным известный противогриппозный препарат ремантадин проявляет антивирусное действие только в отношении штаммов вируса гриппа серотипа А, но не В.

П р и м е р 4. Токсичность глутамата этилового эфира амбена проверена на половозрелых белых мышах (масса 19-21 г) согласно общепринятой методике. При внутримышечном введении результаты опытов показали, что соединение 1 согласно ГОСТ 12.1.007-76 "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности" относится к малотоксичным веществам. Его ЛД₅₀=3080 (2970-3190) мг на 1 кг массы тела животного. При пероральном введении ЛД₅₀= 6490 (6350-6630) мг на 1 кг массы тела животного.

Как видно из табл. 1 и 2 глутамат этилового эфира амбена обладает противовирусной активностью не только в отношении вирусов гриппа серотипа А, но в отличие от ремантадина, и в отношении вирусов гриппа серотипа В, причем это воздействие проявляется в отношении вируса гриппа А в 30, а в отношении вируса гриппа В в 7,5 раз меньшей дозе, чем у глутамата гидразида амбена, соответственно в 100 и 25 раз меньшей дозе, чем у глутамата амбена. Этим определяется его преимущество как перед ремантадином, так и глутаматами амбена и гидразида амбена. Кроме того, заявляемое соединение в 10 раз менее токсично, чем ремантадин.

Изобретение касается производных аминокислот, в частности глутамата этилового эфира амбена, обладающего противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа серотипов А и В, что может быть использовано в медицине. Цель - создание нового более активного вещества указанного класса. Синтез ведут реакцией этилового эфира амбена с глутаминовой кислотой в среде воды при кипячении. Выход 98% т. пл. 179-181°С, брутто-ф-ла C₁₅H₂₂N₂O₆ токсичность ЛД₅₀ 3080 мг/кг, активность в отношении вируса гриппа А в 30, а в отношении вируса гриппа В в 7,5 раз меньшей дозе, чем при использовании глутамата гидразида амбена. 2 табл.

ГЛУТАМАТ ЭТИЛОВОГО ЭФИРА АМБЕНА, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ ГРИППА СЕРОТИПОВ A И B.

Глутамат этилового эфира амбена формулы

обладающий противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа серотипов A и B.