ГЛУТАМАТ ГИДРАЗИДА N-АМИНОМЕТИЛБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ГРИППА СЕРОТИПОВ А И В Советский патент 1994 года по МПК C07C243/38 A61K31/195 

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к глутамату гидразида п-аминометилбензойной кислоты (амбена) формулы (I)
HOOCCH₂)₂COO^-HCH₂C₆H₄CONH-NH₂,
обладающему противовирусным действием, что предполагает его использование в медицинской практике.

Цель изобретения - поиск новых соединений в ряду производных п-аминометилбензойной кислоты, обладающих антивирусным действием в отношении вирусов гриппа серотипов А и В.

П р и м е р 1. Глутамат гидразида амбена.

16,5 г (0,1 моль) гидразида амбена и 14,7 г (0,1 моль) глутаминовой кислоты кипятят 30 мин в 50 мл воды. К горячей реакционной массе добавляют 5 г активированного угля, раствор фильтруют горячим и охлаждают льдом. Выпавший осадок соединения 1 отфильтровывают, промывают спиртом и сушат. Получают 30,6 г (96%) белого кристаллического глутамата гидразида амбена с т.пл. 182-185^оС (с разложением).

Найдено, %: С 50,20, Н 6,31; N 17,48.

С₁₃Н₂₀N₄О₅
Вычислено, %: С 50,00; Н 6,41; N 17,94.

рН 1%-ного водного раствора 5,6-5,9.

П р и м е р 2. Противовирусная активность глутамата гидразида амбена в отношении вируса гриппа серотипа А.

Исследование проведено на эталонном штамме вируса группа А (Гонконг) 1/68 (Н3N2).

При определении у соединения 1 противовирусного действия его в стерильных условиях растворяют в поддерживающей среде состава, г: NaCl 8,0; КСl 0,6; СаСl₂ 0,8; MgCl₂ 0,05, глюкоза 0,3; желатина 2,0; левомицетин 0,1; фенол-рот 25 мл 0,01% -ного раствора на 1л дистиллированной воды. рН 7,0 (среду стерилизуют при 115^оС в течение 30 мин). На среде, содержащей соединение 1 (опыт) и не содержащей его (контроль), разводят аллантоисный вирус А (Гонконг) 1/68 (Н3N2) до концентрации вируса порядка 100 ЭИД₅₀/мл и 10 контрольных и 10 опытных проб инкубируют 24 ч при 36^оС с фрагментами хорионаллантоисных оболочек (ХАО) 12-14 - дневных куриных эмбрионов. Затем культуральную жидкость из опытных и отдельно контрольных проб объединяют и концентрацию инфекционного вируса в них определяют титрованием десятикратных разведений на новой культуре ХАО. Концентрацию инфекционного вируса рассчитывают методом Кербера в модификации И.П. Ашмарина и выражают в ТИД₅₀.

Поскольку во всех экспериментах каждому опыту соответствует свой контроль, т.е. имеет место случай связанных выборок, то о статической достоверности воздействия судят по непараметрическому критерию знаков (КЗ), что диктует необходимость проведения не менее пяти опытов в серии. Одновременно исследуют прямое вирулицидное воздействие соединения на внеклеточный вирус и его влияние на чувствительность культуры к заражению после предварительной в течение 1 сут. обработки ее с удалением вещества перед инфицированием клеток. В качестве рефренс-вещества используют амбен и глутамат амбена, противовирусное действие которых проявляется в концентрации 10 мг/мл. Полученные результаты приведены в табл.1.

Как следует из табл.1, глутамат гидразида амбена проявляет выраженную антивирусную активность в отношении вируса гриппа А в концентрации 3 мг/мл как при репродукции вируса в его присутствии, так и при предварительной обработке им ткани. Вирулицидного действия в концентрации 3 мг/мл вещество не оказывает. Амбен и глутамат амбена в указанной дозе регулярного антивирусного действия не проявляют. Их наиболее эффективная концентрация 10 мг/мл.

Известно, что противогриппозный препарат ремантадин проявляет антивирусное действие в культуре ткани в отношении вирусов гриппа серотипа А при его концентрации 25-50 мкг/мл.

Таким образом, предлагаемое соединение I в отношении вирусов гриппа серотипа А проявляет более выраженное антивирусное действие, чем амбен и глутамат амбена, но менее выраженное, чем ремантадин.

П р и м е р 3. Противовирусная активность глутамата гидразида амбена в отношении вируса гриппа серотипа В.

Исследование проводят на штамме В (Ленинград) 17/86. При определении антивирусного действия соединения I его предварительно растворяют в спецсреде описанного в примере 2 состава. Затем определяют снижение инфекционной активности вируса В при титровании ее на фрагментах ХАО в присутствии предлагаемого соединения (опыт) по сравнению с инфекционной активностью вируса, определенной в его отсутствие (контроль). Инкубация вируса гриппа В при заражении им фрагментов ХАО во всех вариантах опытов продолжается 72 ч при 34^оС. Расчет ТИД₃₀ и статистическую обработку проводят, как в примере 2. В качестве референс-вещества также используют амбен и глутамат амбена. Результаты исследований представлены в табл.2.

Как следует из табл.2, соединение I проявляет антивирусную активность в отношении вируса гриппа В в концентрации 3 мг/мл при репродукции вируса в присутствии соединения, так и при предварительной обработке им ткани. Вирулицидного действия в концентрации 3 мг/мл вещество не оказывает. Амбен и глутамат амбена в концентрации 3 мг/мл регулярного антивирусного действия не проявляют.

Известный противогриппозный препарат ремантадин проявляет антивирусную активность только в отношении штаммов вируса гриппа серотипа А.

П р и м е р 4. Токсичность глутамата гидразида амбена проверена на половозрелых белых мышах (масса 19 - 21 г) и белых крысах (масса 190 - 250 г) - самцах и самках - согласно общепринятой методике. Учет выживших животных проводится через 24 ч от момента введения.

Белые мыши. Острая токсичность. При внутримышечном введении ЛД₅₀ = 2310 (2200-2420) мг на 1 кг массы тела животного. При пероральном введении ЛД₅₀ = 5900 (4750-7050) мг на 1 кг массы тела животного.

Белые крысы. При пероральном введении ЛД₅₀ = 6300 (4950-7650) мг на 1 кг массы тела животного. При пероральном 10-кратном введении белым крысам соединения I в дозе 1500 мг/кг суммарная доза составила 150000 мг на 1 кг массы тела животного и не влекла их гибели.

Как видно из табл.1 и 2, глутамат гидразида амбена обладает противовирусной активностью не только в отношении вирусов гриппа серотипа А, но, в отличие от ремантадина, и в отношении вирусов гриппа серотипа В. Причем это действие проявляется в дозе, в 3,3 раза меньшей, чем у амбена и глутамата амбена. Этим определяется его преимущество как перед ремантадином, так и перед амбеном и его глутаматом.

Изобретение касается замещенных гидразидов кислот, в частности глутамата гидразида п-аминобензойной кислоты, обладающего противовирусной активностью в отношении вируса гриппа серотипов А и В. Цель - создание нового более активного вещества указанного класса. Синтез ведут кипячением гидразида амбена и глутаминовой кислоты в водной среде. Выход 96%, т.пл. 182-185°С, брутто ф-ла C₁₃H₂₀N₄O₅, токсичность LD₅₀ = 2310 мг/кг (внутримышечно), активность в сравнении с ремантадином выше в 3,3 раза. 2 табл.

Глутамат гидразида n-аминометилбензойной кислоты формулы
HOOCCH₂)₂COO^-HCH₂C₆H₄CONH-NH₂
обладающий противовирусной активностью в отношении вируса гриппа серотипов А и В.