СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРАНУЛЕЗЫ В ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ СКЛЕРОКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ ЖЕНЩИН Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 

Предлагаемый способ сохранения гранулезы фолликулов склерокистозных яичников женщин в гистологических препаратах яичников относится к способам гистологической диагностики состояний и заболеваний яичников женщин, в частности склерокистоза яичников, сопровождающегося гиперплазией гранулезы фолликулов. До установления явления гиперплазии гранулезы существовало представление, что "гистологические изменения в яичниках при их склерокистозе гетерогенны и представляют собой сочетание поликистозной дегенерации с гипертекозом. По мнению Ю. К.Памфамирова, при этом заболевании "кистозная атрезия фолликулов сопровождается распадом и потерей фолликулярного эпителия". Ошибочность этих суждений стала доказуемой лишь при разработке автором способа сохранения в гистологических препаратах гиперплазированной гранулезы.

Предлагаемый способ основан на использовании неизвестной ранее методики сохранения гранулезы фолликулов в гистологических препаратах яичников с последующим определением числа клеток, т.е. морфометрией гранулезы, установлении критериев для определения размеров пласта гранулезы в гистологических препаратах "молодых" фиброзных тел. Такие критерии ранее не были разработаны, и гранулеза фиброзных тел при синдроме склерокистозных яичников (СКЯ) оставалась нераспознанной, а явление ее гиперплазии при этом заболевании - неизвестным.

Известен способ определения гранулезы в гистологических препаратах склерокистозных яичников женщин путем фиксации исследуемой ткани в 10% формалине, приготовления из нее среза, окраски среза гематоксилинэозином или красителем на белок и мукополисахариды и исследованием микроскопически полученного препарата. Ю. К.Памфамиров, исследуя яичники больных с синдромом Штейна-Левенталя (гистологические препараты изготовлены обычным способом, окраска гематоксилин-эозин), установил, что при начальной форме заболевания гранулеза фолликулов может составлять несколько слоев, а при выраженной форме яичники характеризуются отсутствием сохранности гранулезы. Автор приходит к заключению, что потери фолликулярного эпителия происходят вследствие кистозной атрезии фолликулов, характерной для склерокистоза яичников (см. Памфамиров Ю. К. Особенности клинического течения синдрома склерокистозных яичников, его влияния на течение беременности и родов. Реферат по дисс. на соиск. канд.мед.наук, Крымский мединститут, 1980, с.23).

Были подробно описаны фиброзные тела, сосредоточившись на внутренней оболочке, которая по его мнению может состоять из 6-12 рядов клеток. Сравнивая данные автора с результатами собственных исследований можно предполагать, что описанные автором большие эпителиоидные клетки со светлой протоплазмой в фиброзных телах - не что иное, как гранулеза фиброзного тела, ошибочно принятая автором за клетки тека-ткани. Известно, что клетки теки окрашиваются в темный цвет, имеют веретенообразную форму и мало отличаются от клеток стромы.

Недостатки прототипа можно устранить, если в целях сохранения гранулезы кист резецированные кусочки яичника предварительно в течение 10 дней подвергать "подсушиванию" при низкой температуре. Вследствие потери влаги гранулеза уплотняется, "подклеивается" к теке и не подвергается при последующей обработке срезов разрушению (фиг.1-4). В связи с тем, что другие структуры могут выглядеть после высушивания неконтрастными, возможно применение отсасывания фолликулярной жидкости микропипеткой. При этом полость фолликула спадается или приобретает небольшие размеры, вследствие чего гранулеза во время приготовления гистологического препарата сохраняется (фиг.5). Для сохранения гранулезы в крупных фолликулах в процессе "подсушивания" можно прибегать к повышению извне давления, что приводит к сплющиванию фолликула и сохранению гранулезы при последующей обработке среза. Разработать четкие критерии оценки размеров гранулезного края в "молодых" фиброзных телах с последующим подсчетом числа клеток гранулезы (морфометрией).

Целью изобретения является создание условий для сохранения гранулезы фолликулов и критериев количественной оценки состояния гранулезы фолликулов и фиброзных тел, что позволит осуществлять гистологическую диагностику заболеваний у женщин, в частности гиперандрогений различного генеза, морфологически проявляющихся склеpокистозом яичников.

Способ осуществляется следующим образом.

После "подсушивания" кусочки яичников помещают в раствор формалина 10% не более чем на сутки. Затем приготавливают срезы обычным способом. Окраска - гематоксилин-эозин. О количественном состоянии гранулезы судят по числу рядов гранулезы, составляющих гранулезный край, а также по числу клеток гранулезы фолликулов и фиброзных тел в 1 мм² гистологического препарата яичников.

Морфометрические исследования гранулезы кист и фиброзных тел проводят с помощью окулярного микрометра "МОВ-1-15", ок.15^х, об.4,7^х. Количество фолликулов и фиброзных тел, подсчитывали в 1 см² гистологического препарата. Площадь гранулезы кистозно-атрезирующихся фолликулов рассчитывают, определив толщину гранулезного края и принимая условно площадь фолликула за площадь круга с известным радиусом. Ширина гранулезного края кистозно-атрезирующего фолликула по наблюдениям составляет 0,04-0,4 мм; зреющего и зрелого - не более 0,01-0,03 мм. Площадь гранулезы фиброзных тел принимают равной площади той геометрической фигуры, которую они напоминают. Подсчитано, что число клеток гранулезы в 1 мм² гистологического среза яичников составляет в среднем 20320±871 экземпляров 1 (n=17, p<0,001, определено при увеличении: ок. 15^х, об.40^х). Математически подсчет при наличии указанных исходных данных является несложным, при этом использована ЭВМ.

Число клеток гранулезы фолликулов/см² гистологического препарата яичников больных выраженной формы заболевания составило 158260±20216, что в 6,6 раза превышает показатели в контроле (23814±4633). Разница статистически достоверна. У больных начальной формой синдрома СКЯ число клеток гранулезы фолликулов было равно 60960±8708/см² среза, что превышает показатели в контроле в 2,5 раза (p<0,001).

Результаты исследований дают основание утверждать, что гранулеза фолликулов при синдроме СКЯ гиперплазиpована, что слущивание и потеря фолликулами гранулезного края обусловлены разрушающим влиянием на гиперплазированную гранулезу процесса изготовления гистологического среза.

Число клеток гранулезы фиброзных тел при выраженной форме синдрома СКЯ составляло 29700±3841 экз. /см² среза, что в 9 раз выше показателей в контроле (3412±784). При начальной форме заболевания этот показатель (47955±7765) был в 14 раз больше, чем в контроле (p<0,001).

Cпособ позволяет оценивать функциональное состояние яичников по количеству в яичнике гранулезной ткани.

Отмечалось уменьшение окраски до бледно-розовой, клеток гиперплазированной гранулезы распадающихся слоев, обращенных к полости кистозно-атрезирующихся фолликулов. При этом окраска слоев гранулезы, прилежащих к базальной мембране, была наиболее интенсивной, почти фиолетовой. Разница окраски внутренних и наружных рядов гранулезы была пропорциональна степени гиперплазии, и как правило, имела место при численности рядов клеток гранулезы более 30.

Увеличенное число клеток гранулезы фолликулов характерно для больных с ановуляторным циклом, фиброзных тел - для больных с начальной формой заболевания. Кистозный тип атрезии более характерен для однофазного цикла, облитерационный - для 2-фазного, с недостаточной лютеиновой фазой. Во втором случае прогноз оперативного лечения и исхода заболевания более благоприятный.

Увеличенное число клеток гранулезы "молодых" фиброзных тел свидетельствует о недавно прошедшей овуляции, которая после ановуляторного цикла способствовало облитерации кист с превращением их в "молодые" фиброзные тела, что характерно для начальной формы синдрома СКЯ. При длительной ановуляции, напротив, число "молодых" фиброзных тел невелико, преобладают атретические фиброзные тела.

Приведенные критерии функциональной диагностики состояния фолликулярного аппарата склерокистозных яичников ранее, при отсутствии изобретенного способа определения гранулезы, были неизвестны. Но самое главное, без них была бы неизвестной идея: наличие гиперплазированной гранулезы в кистах и фиброзных телах яичников при синдроме СКЯ - причина всех гормональных нарушений, клинических проявлений заболевания. Преимуществом предлагаемого способа является его техническая простота и общедоступность.

Указанные преимущества возникли в связи с тем, что впервые с помощью способа установлено, что отсутствие сохранности гранулезы кист в препаратах склерокистозных яичников, изготовленных известными способами, обусловлено не слущиванием в процессе кистозной атрезии, как полагали ранее, а разрушающим действием на гиперплазированную дистрофизированную гранулезу различных агентов (механическое воздействие, химические вещества), применяемых в процессе изготовления гистологического препарата.

Для обеспечения сохранности гранулезы кист кусочки яичников, резецированные при операции клиновидной резекции яичников больных с синдромом Штейна-Левенталя, подвергают "подсушиванию" в стерильных условиях в рефрижераторе холодильника при температуре -4^оС. Для равномерности высыхания и создания достаточной влажности для поддержания жизнедеятельности клеток, предупреждения их высыхания их хранят в стеклянной 0,2 л банке, накрытой пластмассовой крышкой. Для того, чтобы ускорить процесс потери тканями влаги и уплотнения гранулезы с последующим "подклеиванием" ее к наружно лежащим ее слоям и к теке, резецированные кусочки яичников сразу же после операции плотно завязывают в марлевую стерильную салфетку (из набора для операции) в узел. В такой тугой узел хозяйки обычно завязывают творог и подвешивают для стекания сыворотки, уплотнения творожной массы. Таким же является назначение и узелка с резецированным кусочком яичника. Несколько таких узелков заполняют банку так, что пустого пространства почти не остается и происходит "утряска", подсушивание, но не высыхание тканей. С помощью такого искусственного пресса средние фолликулы, составляющие основную массу фолликулов при синдроме СКЯ, несколько уменьшаются в размере, крупные приобретают сплющенную форму. Период "подсушивания" продолжается не более 10 дней. Таким способом приготовлены яичники гистологических срезов (фиг.1-4). Этот способ пригоден для изготовления срезов при выраженной форме заболевания. Вместе с тем, при начальной форме заболевания фолликулы лишь частично заполнены гранулезой и за указанный срок не успевают "подсохнуть" настолько, чтобы гранулеза "подклеилась". В таких случаях целесообразно прибегать к устранению избытка жидкости путем отсасывания ее микропипеткой из полости фолликула (см. фиг.5). Этот вариант сохранения гранулезы помогает избегнуть нечеткости рисунков от длительного воздействия хранения и холода. Способ сохранения гранулезы путем устранения из фолликула жидкости непригоден при выраженной форме заболевания и длительном ановуляторном цикле, так как яичники представляют собой при этом некоторое подобие медовых сот, фолликулы многочисленны и недоступны пункции.

Обработка раствором формалина используется лишь в тех методиках, в которых предусмотрено его применение, при этом концентрация не должна превышать 10%, экспозиция не более 1 сут. Установлено, что длительное пребывание кусочков яичников в растворе формалина резко снижает число фолликулов с сохранившейся гранулезой. Последующая обработка препаратов проводится в соответствии с общепризнанными методиками.

На фиг.1-6 даны следующие пояснения: На фиг.1 - кистозно-атрезирующийся фолликул (диаметр 6 мм). Число рядов клеток гранулезы 8-10. Препарат приготовлен методом "подсушивания" на холоду. Стрелками указана толщина гранулезного края. (Склерокистоз яичников. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличено в 70 раз).

На фиг. 2 - кистозно-атрезирующийся фолликул. Полость заполнена дезорганизованной массой гранулезы, стрелкой указано место расположения базальной мембраны. Окраска окружающих фолликул тканей более интенсивна, чем его содержимого. Синцитий гранулезы имеет самую слабую окраску. Препарат приготовлен методом "подсушивания". (Склерокистоз яичников. Шик-реакция. Увеличено в 56 раз).

На фиг.3 - Граафов фолликул. Гранулеза содержит более 30 рядов клеток. Препарат приготовлен методом "подсушивания" на холоду. (Склерокистоз яичников. Выраженная форма. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличено в 70 раз).

На фиг. 4 - яичник женщины контрольной группы. Фолликул средних размеров. В полости фолликула отслоившаяся гранулеза. Число рядов клеток 2-4. Препарат приготовлен методом "подсушивания" на холоду. (Окраска гематоксилин-эозин. Увеличено в 70 раз).

На фиг.5 - кистозно-атрезирующийся фолликул сплющенной формы. Сохранение гранулезы в препарате достигнуто методом пунктирования фолликула и отсасывания фолликулярной жидкости. В нижней части фолликула в месте пункции видна отслоившаяся гранулеза. (Склерокистоз яичников. Начальная форма заболевания. Число рядов клеток гранулезы 8-10. Окраска - гематоксилин-эозин. Увеличено в 70 раз).

На фиг.6 - фиброзное тело с едва различимым краем гранулезы. Внутренний ее край - синцитиеобразная масса гранулезы, сливающаяся с гиалиновым венчиком. Препарат приготовлен методом высушивания на холоду, что, впрочем, для определения гранулезы фиброзного тела не имеет существенного значения. (Склерокистоз яичников. Увеличено в 70 раз. Окраска - гематоксилин-эозин).

Отличительной особенностью фолликулов препаратов яичников, изготовленных предлагаемым способом, является:
- плотность фолликулов 2,5-3 мм в диаметре, как правило, полностью заполнена гранулезой (фиг.2);
- средние и крупные кистозно-артезирующиеся фолликулы представляют собой кисты с утолщенным краем гранулезы, насчитывающим 30 и более рядов клеток (фиг.1-3);
- гранулеза граафова фолликула гиперплазирована (фиг.3).

Определение числа клеток гранулезы фиброзного тела можно проводить в гистологических препаратах, изготовленных обычным способом. При этом отмечается ряд трудностей, связанных с нахождением границ гранулезы, так как базальная мембрана фиброзных тел часто неразличима и гранулезный край выглядит неконтрастным, клетки теки теряют свое обычное расположение по кругу и становятся мало отличимыми от клеток стромы.

Отличить гранулезу фиброзных тел можно по характерной зернистости строения и более светлой окраски ее протоплазмы клеток. Кроме того, внутренний и наружный край гранулезы имеет различную плотность расположения клеток: прилежащий к теке, внутренний край, состоит из густо расположенных клеток, наружный - примыкающий к гиалиновому венчику, в связи с редким расположением клеток напоминает синцитий. В пределах гиалинового венчика гранулезные клетки расположены группами или в одиночку - это прижизненно слущенные клетки. Они смешиваются с содержимым фолликула (распавшиеся клетки, гормоны и пр. ). В процессе облитерационной артезии фолликула происходит прижизненная потеря влаги, вследствие чего содержимое полости фолликула приобретает размеры, соответствующие размерам ее плотного остатка, так образуется гиалиновый венчик, имеющий на стерах, окрашенных гематоксилин-эозином, светло-розовую окраску. Таким образом, несложно понять, что гиалиновый венчик размером и формами воспроизводит полость фолликула, сохранившуюся в редуцированном виде в процессе облитерационной атрезии. Судя по отсутствию гранулезы в атретических фиброзных телах, можно утверждать, что гиалиновый венчик атрезируется в последнюю очередь (см. фиг.6).

В кистозно-атрезирующихся фолликулах при синдроме СКЯ отмечается уменьшение окраски до бледно-розовой клеток гранулезы внутренних слоев, обращенных в полость фолликула, и увеличение интенсивности окраски до фиолетовой (окраска гематоксилин-эозин) ее наружных, прилежащих к базальной мембране, слоев. Этот симптом является важным отличительным признаком гиперплазированной гранулезы и, соответственно, патоморфофлогическим критерием синдрома СКЯ (фиг.2. и 3).

Диагноз синдрома СКЯ устанавливается по состоянию гранулезы фиброзных тел и кист. Атрезия кист по типу облитерационной с образованием фиброзных "молодых" тел начинается, можно полагать, под влиянием эпизодической овуляции, и желтое тело, каким бы неполноценным ни было при синдроме СКЯ, подавляет дальнейшее развитие кист, организуя их в фиброзные тела. Наоборот, длительное отсутствие овуляции приводит к расцвету кист, при этом хорошо выражена разница окраски наружных и внутренних слоев гранулезы кист.

Разработка данного способа позволило дать новую трактовку понятия атретического фиброзного тела: предлагается принимать гиалиновый венчик, лишенный гранулезы. Ранее за атретическое фиброзное тело принимали любое образование, имеющее гиалиновый венчик, так как гранулеза фиброзных тел оставалась нераспознанной. При этом число фиброзных атретических тел являлось явно преувеличенным, а "молодых" - уменьшенным. Способ позволяет распознать гранулезу кист и "молодых" фиброзных тел с помощью симптома разницы окраски наружных и внутренних ее слоев.

Таким образом, в свежих (молодых) фиброзных телах имеется гранулеза, которая отличается от тека-ткани и стромы зернистостью строения и более светлой окраской протоплазмы клеток. Наружный край гранулезы окружен текой и в связи с разрушением базальной мембраны едва различим, клетки его располагаются густым частоколом. Внутренний край гранулезы фиброзного тела непосредственно прилегает к гиалиновому венчику и напоминает синцитий (фиг. 6). Гиалиновый венчик своими размерами и формой воспроизводит полость фолликула, сохранившуюся в процессе облитерационной атрезии в редуцированном виде, содержит гранулезные клетки, располагающиеся группами или в одиночку (фиг.6).

Эти сведения о фиброзных телах при синдроме СКЯ стали известны с вязи с изобретением методики сохранения гранулезы кист, после чего стало понятно, что "молодые" фиброзные тела - это те же самые кисты, но лишь прижизненно "подсушенные". Таким образом, изобретение способа сохранения гранулезы кист "подсмотрено" и скопировано у природы на примере сохранения гранулезы фиброзных тел.

Предлагаемый способ основан на выявлении неизвестного ранее при этом заболевании свойства - гиперплазии гранулезы фолликулов и фиброзных тел.

П р и м е р 1. Больная Б., 26 лет. Поступила с жалобами на бесплодие, гирсутизм (усы и борода), нерегулярные месячные, последняя менструация 3 мес. назад. Нарушения менструального цикла отмечаются с 14 лет. Диагноз синдрома Штейна-Левенталя, выраженная форма, установлен на основании данных гормональных исследований и пневмопельвеографии. Во время операции клиновидной резекции установлено, что яичники увеличены по сравнению с нормальными в 3 раза. Для изготовления гистологического препарата кусочки яичников хранили для "подсушивания" при -4^оС в течение 10 дней. Из другого кусочка яичников приготовили водный экстракт для определения активности ингибина по Чари (она в 3 раза превышала ингибиторную активность нормальных яичников). После "подсушивания" кусочки яичников фиксировали в течение 18 ч в 10%-ном растворе формалина. Приготовленный затем обычным способом срез окрашивали гематокислин-эозином. На гистологическом препарате размером 3 см² было 60 примордиальных фолликулов и 15 кистозно-атрезирующихся размером 3-12 мм в диаметре. С сохранившейся гранулезой было 5 фолликулов (3-7 мм в диаметре). Число рядов клеток гранулезы в них составляло 8-25, толщина гранулезного края 0,09-0,15. При обзорной микроскопии установлено, что желтые и белые тела отсутствуют, кровеносные сосуды склерозированы. Тека состоит из многих (многочисленных) слоев. Много атретических и свежих, содержащих гранулезу фиброзных тел. В строме и корковом слое разрастание соединительной ткани.

Площадь гранулезы фолликулов представляла собой разность площадей большого круга (максимальный диаметр яичника в поперечнике) и малого (диаметр его - большой диаметр круга минус ширина гранулезного края фолликула, умноженная на 2). Сумма площадей гранулезы исследованных фолликулов составляла: 2,39-1,41+3,22+7,06+0,67= 14,08 мм². В 1 мм² гранулезы гистологического среза содержится, как установлено, 20320 экз. клеток гранулезы. Следовательно, в перерасчете на 1 см² гистологического среза гранулеза фолликулов составляла 286105 клеток, что в 11 раз больше, чем в норме (23814±4633). Общее число фиброзных тел в этом же гистологическом препарате было 9, из них 6 содержали гранулезу площадью 1,8 мм² и числом клеток 36576, что в 10 раз больше, чем в контроле (3413±784).

Таким образом, у больной с выраженной формой склеpокистоза яичников результаты гистологических исследований позволяют установить наличие гиперплазии гранулезы фолликулов, свойственной этому заболеванию, что находит подтверждение в повышенном содержании как в сыворотке крови (преальбуминовая фракция сыворотки крови составила 13,8%, что в 1,8 раза больше, чем в контроле), так и в ткани яичников (в 3 раза больше, чем в контроле) гормона ингибина.

На этом примере легко убедиться, что предлагаемый гистологический тест диагностики гиперплазии гранулезы может служить тестом диагностики ингибино-образовательной функции яичников, которая, как видно из результатов исследований, повышена.

П р и м е р 2. Больная Н. Диагноз: синдром Штейна-Левенталя, начальная форма. Из анализа известно, что страдает опсо- и аменореей с менархе. Задержки месячных до 2-3 мес. Под влиянием лечения гормонами наступила овуляция с недостаточной лютеиновой фазой (установлено гормональными исследованиями и с помощью измерения базальной температуры тела). До проведения гистологического исследования кусочки яичников "подсушивали" в течение 2 недель. Содержание "ингибина" в сыворотке крови приближалось к нормальному.

Гистологическое исследование позволило выявить: наличие желтого тела типа атретического, примордиальные фолликулы более 100/см² среза, развившиеся малые и большие фолликулы. Фолликулы размером 2-6 мм в диаметре (площадью 3 мм²) имели не более 4-8 рядов гранулезы (общее число клеток 60960/см² гистологического препарата), что незначительно, лишь 1,5-2 раза превышало показатели в контроле. Отмечалось большое число фиброзных тел - 21, различных размеров, из них 14 содержали гранулезу (2,36 мм² с общим числом клеток 47955), что более чем в 10 раз превышало показатели в контроле.

Таким образом, на конкретных примерах видно, что результаты гистологического и гормональных исследований совпадают и дают основание утверждать, что источником повышенной продукции ингибина является гиперплазированная гранулеза кистозно-атрезирующихся фолликулов.

Использование: в области медицины, в частности в гистологии. Сущность изобретения: кусочки яичников подсушивают в течение 10 дней при температуре от минус 4 до 0°С либо осуществляют пункцию фолликула до придания ему формы неправильного овала, а затем фиксируют в 10%-ном формалине в течение не более 1 ч, готовят срез, окрашивают его гематоксилин-эозином или другим красителем на белок и мукополисахариды с последующим микроскопическим исследованием полученного препарата, а определение гранулезы фолликулов и фиброзных тел осуществляют по наличию розовой окраски ее наружных слоев, обращенных к базальной мембране. 6 ил.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРАНУЛЕЗЫ В ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ СКЛЕРОКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ ЖЕНЩИН путем фиксации исследуемой ткани в 10%-ном формалине, приготовления из нее среза, окраски его гематоксилин-эозином или красителем на белок и мукополисахариды с последующим микроскопическим исследованием полученного препарата, отличающийся тем, что предварительно исследуемый материал подвергают подсушиванию в течение 10 дней при -4 - 0^oС либо осуществляют пункцию фолликула до придания ему формы неправильного овала, а фиксацию в 10% -ном формалине проводят не более 1 ч и определение гранулезы фиброзных тел осуществляют по наличию розовой окраски ее внутренних слоев, обращенных в полость фолликула, и увеличению интенсивности окраски до фиолетового ее наружных слоев, обращенных к базальной мембране.