ШТАММ STREPTOMYCES ORNATUS - ПРОДУЦЕНТ КЕРАТИНАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/50 C12N9/50 C12R1/465 

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано в птицеперерабатывающей промышленности для получения полноценных белковых лизатов из отходов переработки птицы.

Из литературных источников известно, что среди микроорганизмов только патогенные грибы (дерматофиты), отдельные виды бактерий и актиномицетов обладают способностью вырабатывать ферменты, разрушающие кератин [1-4]
По мнению некоторых авторов, эта способность у бактерий и актиномицетов является следствием высокой гетерогенности протеолитических ферментных комплексов.

Невозможность целевого использования некоторых вышеупомянутых аналогов патогенность или условная патогенность, недостатком же других является длительность культивирования и низкая кератинрасщепляющая способность.

Наиболее близким решением-прототипом является использование в качестве продуцента кератинрасщепляющего фермента актиномицета Streptomyces fradiaspirales ВКМ-А-157 [5]
Способ культивирования продуцента по прототипу осуществляют следующим образом:
Культуру актиномицета Str.fradiaspirales ВКМ-А-157 выращивают на среде следующего состава, г/л: картофельный крахмал 70; соевая мука 20; KH₂PO₄ 1,5; FeSO₄ 0,015; ZnSO₄ 0,01; CaCO₃ 4,0. Среда готовится на водопроводной воде, рН перед стерилизацией 7,0-7,2. Длительность культивирования 160 ч при температуре 28-30^оС. Питательную среду засевали 5% (по объему) посевным материалом, которым служила 48 часовая культура, выращенная глубинно на среде, г/л: картофельный крахмал 20; соевая мука 20; (NH₄)₂SO₄ 3,0; CaCO₃ 3,0; KH₂PO₄ 0,5; NaCl 2,5; водопроводная вода до 1 л, рН 7,4. Посевной материал засевали 5% (по объему) суспензией конидий, выращенной в термостате при 30^оС 12 сут. Активность кератиназы в культуральной жидкости соответствовала 1-1,2 ед/мл. (Единицы по методу Yu et al. что соответствует 6,8-8 мг/л измеренной в диссертации).

К недостаткам продуцента можно отнести низкую активность кератиназы, длительность культивирования.

Цель настоящего изобретения получение более активного по сравнению с прототипом штамма кератинрасщепляющего фермента. В СНГ до настоящего времени из-за отсутствия продуцента нет промышленного производства этого фермента.

Штамм был выделен из горных районов Армении. Штамм Streptomyces ornatus депонирован в музее ВКПМ под номером S-1220.

От известных продуцентов штамм Str.ornatus отличается высокой продуктивностью кератиназы, меньшими сроками культивирования и биосинтеза фермента. Штамм культивируют в глубинных условиях на жидкой питательной среде.

Температурный оптимум культивирования продуцента 30^оС, рН 7,0-7,2; длительность культивирования составляет 72-90 ч. При этом кератиназная активность продуцируемого фермента составляет 7,2-7,8 ед/мл.

Активность кератиназы определяют по методу Yu et. al. (Yu, RY. Harmon, S.R. and Blank F. I Solation and purification of an extracellular keratinase of Prichophyton mentagraphytes. //J. of Bacterial. 1968. vol.96, No.4. p. 1435).

За единицу активности фермента принято изменение показания спектрофотометра при 280 нм при определенных условиях гидролиза (30^оС, рН 7,0) на 0,1 единицу за единицу времени по сравнению с контролем.

Культурально-морфологические признаки культуры актиномицета Streptomyces ornatus
Культура Str.ornatus образует прямые спороносцы. По данным электронно-микроскопического излучения споры прямоугольные, с гладкой поверхностью. Воздушный мицелий на синтетических средах от светло-серого (А6), кремового (Б6) до палево-желтеющего (О4+Ж6). Субстратный мицелий от желтовато-бурого (Б5), золотисто-желтого (М7) до желтого (П5). На среде Гаузе 1 отдельные участки окрашены в красно-буроватый цвет (В1). Растворимый пигмент на основных диагностических средах от бурого (К1+Б5), песочно-бурого (З6+Б5) и до желто-бурого (Д4).

На органических средах воздушный мицелий от светло-серого (А6), желтовато-серого (В3), палевого (О4) до желтеющего (Ж6). Субстратный мицелий от песочно-буроватого (36+Б4), золотисто-желтого (М7) до желтовато-буроватого (Б4+Б5). Растворимый пигмент от песочного (З6) до буровато-желтого (Б5+Б4).

Меланоидный пигмент не образует.

Рост продуцента Str. ornatus на различных диагностических средах (температура роста 30^оС в течение 7 сут).

Минеральный агар Гаузе 1. Рост хороший. Воздушный мицелий палево-желтеющий (О4+Ж6). Субстратный мицелий красновато-бурый до желто-бурого (В1+В5). Растворимый пигмент бурый (К1).

Среда Чапека. Рост хороший. Воздушный мицелий темно-кремовый до желтеющего (О6+Ж6). Субстратный мицелий от золотисто-желтого до буро-желтого (М7-Б4+Б5). Растворимый пигмент светло-буро-коричневатый (К7+Д1).

Ср. 1 с глюкозой. Рост хороший. Воздушный мицелий палево-желтеющий (О4+Ж6). Субстратный мицелий желтовато-буроватый до бурого (Б4+Б5). Растворимый пигмент нет или буроватый (К1).

Крахмальный агар. Рост обильный. Воздушный мицелий от серно-желтого до соломенно-желтого (И1+Л2). Субстратный мицелий от желтого до буро-желтого (П5-Б4+Б5). Растворимый пигмент песочный (З6).

Крахмально-аммиачная среда. Рост умеренный. Воздушный мицелий кремовый (Б6). Субстратный мицелий желтый (П5). Растворимый пигмент восково-желтый (З3).

Среда Линденбайна. Рост слабый. Воздушный мицелий палево-желтеющий (О4+Ж6). Субстратный мицелий золотисто-желтый до буро-желтого (М7-Б4+Б5). Растворимый пигмент желтовато-рыжевато-бурый (Ж2+Д4).

Глюкозо-аспарагиновая среда. Рост слабый. Воздушный мицелий от белесого до кремового (Д1-Б6). Субстратный мицелий бледно-желтовато-бурый (Д1+Д4). Растворимый пигмент отсутствует.

Глицерин-аспарагиновая среда. Рост от умеренного до хорошего. Воздушный мицелий светло-серый (А6). Субстратный мицелий желтовато-бурый (Б4+Б5). Растворимый пигмент бледно-песочный (З6+Д1).

Среда Ваксмана. Рост умеренный. Воздушный мицелий желтеющий (Ж6). Субстратный мицелий от золотисто-желтого до желто-бурого (М7-Д4+Б5). Растворимый пигмент желтовато-буроватый (Б5+Д4).

Овсяная среда. Рост обильный. Воздушный мицелий желтеющий (Ж6). Субстратный мицелий от песочно-бурого до оливково-серого (З6+Б4+Н1). Растворимый пигмент песочно-буроватый (З6+Б5).

Солодовая среда. Рост умеренный. Воздушный мицелий желтеющий (Ж6). Субстратный мицелий от золотисто-желтого до желто-бурого (М7-Б5). Растворимый пигмент желтовато-рыжевато-бурый (Ж2-Б5).

Гаузе 2. Рост от умеренного до хорошего. Воздушный мицелий от белесого до светло-серого и кремового (А6+Б6+Д1). Субстратный мицелий желтовато-буроватый (Б5). Растворимый пигмент отсутствует.

МПА. Рост очень слабый. Воздушный мицелий отсутствует. Субстратный мицелий кремовый (Б6). Растворимый пигмент отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки
Культура Streptomyces ornatus аэроб, оптимум роста 30^оС. Молоко коагулирует и пептонизирует, желатину разжижает, крахмал гидролизует, на клетчатке не растет. На ломтиках картофеля рост хороший. Меланоидные пигменты не образует.

Использование источников углерода
Хорошо растет на D-ксилозе, DL-сахарозе, L-арабинозе, D-мальтозе, D-фруктозе, L-рамнозе, D-манните. Умеренно растет на D-глюкозе, D-галактозе, слабо растет на D-лактозе, L-инозите и не растет на D-раффинозе и D-сорбите.

П р и м е р. Штамм Streptomyces ornatus выращивают в пробирках со скошенной средой Гаузе в течение 7 сут в термостате при температуре 30^оС. Полученный споровый материал засевают на жидкую среду следующего состава, г/л: картофельный крахмал 20; соевая мука 20; (NH₄)₂SO₄ 3,0; NaCl 2,5; KH₂PO₄ 0,5; CaCO₃ 3,0; вода водопроводная до 1 л, рН среды 7,0. Культивирование микроорганизмов проводят в колбах емкостью 750 мл (100 мл среды) на круговой качалке (220 об/мин) при температуре 30^оС в течение 24 ч. Полученный вегетативный посевной материал в количестве 5% по объему к среде засевают на питательную среду следующего состава, г/л: картофельный крахмал 40; измельченное перо 20; NaCl 2,5; MnCl₂ 0,5; KH₂PO₄ 1,5; CaCO₃ 4,0; водопроводная вода до 1 л, рН среды 7,0 и выращивают в колбах емкостью 750 мл (100 мл среды) на круговой качалке при температуре 30^оС в течение 78 ч.

Ферментативная активность кератиназы составляет 7,3 ед/мл.

Установлено, что штамм Streptomyces ornatus обладает большей кератиназной активностью по сравнению с прототипом и его использование рентабельно в промышленности.

Использование: в биотехнологии, пищеперерабатывающей промышленности для получения полноценных белковых лизатов из отхода переработки птицы. Сущность изобретения: штамм Streptomyces ornatus ВКПМ S-1220 на питательной среде, содержащей, г/л: картофельный крахмал 40; измельченное перо 20; NaCl 2,5; MnCl₂ 0,5; KH₂PO₄ 1,5; CaCO₃ 4,0; водопроводная вода до 1 л за 78 ч культивирования проявляет кератиназную активность 7,3 ед/мл. Препарат, полученный из культуры актиномицета Str. ornatus, может быть использован для получения полноценных белковых лизатов с высокой усвояемостью для кормления цыплят-бройлеров в птицеперерабатывающей промышленности.

Штамм Streptomyces ornatus ВКПМ S-1220 продуцент кератиназы.