СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БАЛИЗ Российский патент 1995 года по МПК A61K35/74 C12P1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к медицинской промышленности и касается разработки способов получения лекарственных средств.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения бализа, заключающийся в глубинной ферментации (в течение 72-96 ч) бактерий Gluconobacter oxydans В 2380 на питательной среде, содержащей глюкозу, калий фосфорнокислый, дрожжевой автолизат и воду. Затем фильтрат подвергается ионообменной очистке.

При этом предварительное выращивание посевного материала для ферментации проводят сначала в течение 36-48 ч на твердой питательной среде, содержащей глюкозу, агар, калий фосфорнокислый, жидкий дрожжевой автолизат и воду. Затем стерильной обессоленной водой смывают клетки штамма-продуцента, переносят в жидкую питательную среду, содержащую глюкозу, фосфорнокислый калий, жидкий дрожжевой автолизат и воду, и выращивают в течение 18-24 ч. Вновь проводят пересев на питательную среду такого же состава, выращивают в течение 18-24 ч и только затем переносят посевной материал в ферментеры.

Таким образом от момента начала подготовки посевного материала до засева ферментеров проходит 72-96 ч.

Существующий способ получения бализа длителен по времени и не обеспечивает высокого выхода препарата.

Целью изобретения является сокращение сроков получения и увеличение выхода препарата бализ.

Поставленная цель достигается тем, что выращивание посевного материала бактерий рода Gluconobacter проводят на жидкой питательной среде, содержащей, маннит 2,5; пептон 0,3; дрожжевой автолизат жидкий 5,0 и вода обессоленная до 100, а в известную ферментационную среду дополнительно вводят аммоний фосфорнокислый двузамещенный в количестве 0,003-0,01%
П р и м е р 1. В четыре ферментера объемом 100 л каждый загружали по 70 литров ферментационной седы, содержащей, глюкоза 4,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,01; жидкий дрожжевой автолизат 0,5 и обессоленная вода до 100.

В ферментеры N 1 и N 2 вносили посевной материал (в количестве 0,5% по объему) бактерий Gluconobacter oxydans B 2380, а в ферментеры N 3 и N 4 бактерий Gluconobacter oxydans ВКМ В-1974 Д.

Выращивание посевного материала для ферментеров N 1 и N 3 проводили в течение 36 ч на питательной среде состава, мас. агар 1,5; глюкоза 2,5; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,01; дрожжевой автолизат жидкий 3,0; вода до 100. Затем пересевали на жидкую питательную среду следующего состава, мас. глюкоза 4,0; фосфорнокислый калий однозамещенный 0,01; автолизат дрожжевой жидкий 0,5; вода до 100. Инкубировали в течение 18 ч. Затем пересевали на такую же питательную среду и инкубировали в течение 24 ч.

Для ферментеров N 2 и N 4 посевной материал выращивали в течение 48 ч на жидкой питательной среде, содержащей, маннит 2,5; пептон 0,3; дрожжевой автолизат жидкий 5,0 и обессоленная вода до 100.

Ферментации проводили при одинаковой температуре и подаче стерильного воздуха. Через 24, 48, 60, 72 и 84 ч отбирали пробы культуральной жидкости и определяли содержание бализа.

Результаты приведены в табл.1.

Согласно промышленному регламенту на получение препарата бализ ферментация считается завершенной, когда содержание бализа в двух соседних пробах не отличается.

Из табл.1 видно, что использование для выращивания бактерий рода Gluconobacter жидкой питательной среды с маннитом позволяет не только сократить время подготовки посевного материала на 24-48 ч, но и приводит к увеличению выхода бализа к моменту окончания ферментации в среднем на 10%
П р и м е р 2. В 6 ферментеров загружали по 70 л ферментационной среды, состав которой приведен в табл.2.

В каждый ферментер вносили (в количестве 0,5% по объему) посевной материал бактерий Gluconobacter oxydans В-2380, выращенный на питательных средах с глюкозой. Глубинную ферментацию проводили в одинаковых условиях. Через 24,48,54,60,72 и 84 ч отбирали пробы и определяли содержание бализа в культуральной жидкости. Результаты приведены в табл.3.

Как видно из табл.2 и 3 добавление в ферментационную сред двузамещенного фосфорнокислого аммония в количестве 0,003-0,01% (ферментер 4-6) приводит к увеличению выхода бализа к моменту окончания ферментации на 10%
Введение в среду фосфорнокислого аммония ниже нижней границы (ферментер 2) не влияет на образование бализа, а добавление аммония в количествах, превышающих верхнюю границу (ферментер 6) приводит к угнетению биосинтеза препарата.

После ионообменной очистки и стандартизации препарат бализ, полученный из всех шести ферментеров соответствовал требованиям фармакопейной статьи 42-2616-89.

П р и м е р 3. В 6 ферментеров загружали по 70 л ферментационной среды, как указано в табл.2. В каждый ферментер вносили (в количестве 0,5% по объему) посевной материал бактерий Gluconobacter oxydans В-2380, выращенный на питательной среде, содержащей, маннит 2,5, пептон 0,3, дрожжевой автолизат жидкий 5,0 и вода обессоленная до 100.

Ферментацию проводили в одинаковых условиях. Из каждого ферментера через 24, 48, 54, 60, 72 и 84 ч отбирали пробы и определяли в них содержание бализа. Результаты приведены в табл.4.

Как видно из табл.4, совместное использование предварительного выращивания посевного материала бактерий Gluconobacter oxydans В-2380 на жидкой питательной среде с маннитом и добавление в ферментационную среду аммония фосфорнокислого двузамещенного способствует не только увеличению выхода бализа на 15% по сравнению с прототипом, но и позволяет сократить время ферментации до 54 ч.

После проведения ионообменной очистки и стандартизации бализ, полученный из всех ферментеров соответствовал требованиям ФС 42-2616-89.

П р и м е р 4. В 6 ферментеров загружали по 70 л ферментационной среды, с соотношением компонентов, как указано в табл.2. В каждый ферментер вносили посевной материал бактерий Gluconobacter oxydans ВКМ В-1974 Д (в количестве 0,5% по объему), выращенный на питательной среде, содержащей, маннит 2,5; пептон 0,3; дрожжевой автолизат жидкий 5,0 и обессоленная вода до 100. Ферментацию проводили в одинаковых условиях. Через 24, 48, 54, 60, 72 и 84 ч с начала ферментации отбирали пробы культуральной жидкости и проводили определение содержания бализа. Результаты исследования приведены в табл.5.

Как видно из приведенных данных, предлагаемый способ получения бализа и при использовании в качестве посевного материала бактерий Gluconobacter oxydans ВКМ В-1974 Д приводит к увеличению содержания препарата в культуральной жидкости на 10% и позволяет сократить время ферментации на 18 ч.

После очистки на ионообменниках и стандартизации бализ, полученный во всех ферментерах соответствовал ФС 42-2616-84.

Таким образом, способ получения бализа с использованием предварительного выращивания посевного материала бактерий рода Gluconobacter на питательной среде с маннитом и добавлением в ферментационную среду аммония фосфорнокислого в количестве 0,003-0,01% позволяет сократить срок получения препарата минимум на 42 ч и увеличить количество получаемого бализа на 10-15%

Использование: биотехнология, лекарственный препарат, бализ. Сущность изобретения: предварительное выращивание посевного материала из бактерий вида Gluconobacter oxydans проводят на питательной среде, содержащей маннит, пептон, дрожжевой автолизат и воду. Перед ферментацией в ферментационную среду дополнительно вводят аммоний фосфорнокислый в количестве 0,003 - 0,01% , а глубинную ферментацию осуществляют в течение 54 ч. Это позволяет увеличить выход препарата бализ в среднем на 10% и сократить срок получения препарата на 42 ч. 5 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БАЛИЗ, включающий выращивание посевного материала из бактерий вида Gluconobacter oxydanS, глубинную ферментацию выращенного посевного материала в ферментационной среде, содержащей глюкозу, калий фосфорнокислый, дрожжевой автолизат и воду, отделение культуральной жидкости с последующей ионнообменной очисткой целевого продукта из фильтрата, отличающийся тем, что выращивание посевного материала проводят на питательной среде, содержащей, мас. маннит 2,5; пептон 0,3; дрожжевой автолизат 5,0 и воду остальное, перед глубинной ферментацией в ферментационную среду дополнительно вводят аммоний фосфорнокислый в количестве 0,003 0,01% а глубинную ферментацию осуществляют в течение 54 ч.