СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РАСТЕНИЙ Российский патент 1995 года по МПК C12N5/00 C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, биохимии, физиологии растений, клеточной и генетической инженерии, в частности к получению клеточных структур, лишенных клеточной стенки.

Известны способы получения протопластов растений [1,2,3] при которых в качестве мацерирующих ферментов используют препараты Onozuka R-10, Macerozim, Cellulolysin и др. В некоторых случаях [4] возможно совместное использование отечественных (ксиланаза) и импортных препаратов.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ обработки пересадочной культуры растительной ткани для проведения цитометрического контроля и получения протопластов [6] при котором протопласты образуются в смеси с клетками и конгломератами клеток после 4-10 ч инкубирования при 20-30^оС и 2-4 ч при 22-26^оС (обе стадии с перемешиванием) в количестве 60% от массы.

Недостатком этого способа получения протопластов является то, что они образуются в смеси с клетками, время их получения продолжительно, обработка ферментами проходит в два этапа при высокой концентрации последних. Кроме того, штамм Bacillus macerans, продуцент мацерирующих ферментов, является спорообразующим.

Целью изобретения является упрощение и удешевление способа получения, расширение набора ферментов, пригодных для этой цели, сокращение времени обработки, получение чистой суспензии протопластов.

Цель достигается использованием комплекса пектолитических ферментов (мацераза С), продуцируемых бактериями Erwinia chrysanthemi ENA49-5 [5] и обладающего пектат-лиазной и пектин-метил-эстеразной активностями, с целловиридином ГЗх, в результате чего время обработки растительной ткани в 0,5 М растворе сахарозы сокращается до 3-6 ч, повышается жизнеспособность образующихся протопластов и снижается их гибель.

П р и м е р 1. Листья асептически выращенных растений картофеля нарезали полосками размером 3-5 мм и переносили в раствор следующего состава, мг/л: КН₂РО₄- 27,2; KNO₃ 101,0; MgSO₄ ˙ 7 H₂O 246,0; KJ 0,16; CuSO₄ ˙ 5H₂O 0,025; CaCl₂ -1480,0; сахароза 171000; целловиридин ГЗх 10000; мацераза С 0,03; рН 5,8. Инкубировали 3-6 или 18 ч в темноте при 24-28^оС. Результаты выделения протопластов из листьев картофеля приведены в таблице.

П р и м е р 2. Из предварительно вымытых и простерилизованных клубней картофеля вырезали диски размером 3х3 мм, помещали в ферментный раствор следующего состава, мг/л: КН₂РО_4- 27,2; KNO₃ 101,0; MgSO₄ ˙ 7H₂O 246,0; KJ 0,16; CuSO₄ ˙ 5H₂O 0,25; CaCl₂ 1480,0; сахароза 171000; мацераза С 0,03; рН 5,8. Инкубировали 3-18 ч в темноте при 24-28^оС. Результаты выделения протопластов приведены в таблице.

П р и м е р 3. Листья 30-дневных растений табака освобождали от нижнего эпидермиса и переносили в ферментный раствор следующего состава, мг/л: KH₂PO₄ 27,2; KNO₃ 101,0; MgSO₄ ˙ 7H₂O 246,0; KJ 0,16; SuSO₄ ˙ 5H₂O 0,025; CaCl₂ 1480,0; сахароза 171000; мацераза С 0,015; целловиридин ГЗх 5000; рН 5,8. Инкубировали 3-6 ч в темноте при 20-28^оС. Результаты выделения протопластов приведены в таблице.

Данный способ обладает следующими преимуществами:
а) возможностью замены импортных ферментных препаратов отечественными (целловиридин ГЗх), а также пектолитическими, продуцируемыми бактериями Erwinia chrysanthemi ENA49-5; б) упрощением и удешевлением способа получения за счет сокращения времени обработки растительной ткани до 3-6 ч; проведения процесса при комнатной температуре без перемешивания; в) получением однородной суспензии жизнеспособных протопластов.

Использование: биотехнология, клеточная инженерия. Сущность изобретения: растительные протопласты получают путем инкубации ткани в растворе ферментных препаратов, при этом в качестве пектолитического препарата используют мацеразу С, полученную при микробиологическом синтезе, а в качестве целлюлолитического - целловиридин ГЗх. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РАСТЕНИЙ, включающий обработку растительной ткани комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментных препаратов в растворе 0,5 М сахарозы, отличающийся тем, что в качестве пектолитического ферментного препарата используют препарат мацеразу С, продуцируемую бактериями Erwinia chrysanthemi ENA 49-5, обладающую пектат-лиазной и пектин-метил-эстеразной активностью, а в качестве целлюлолитического - целловиридин ГЗх.