ШТАММ MICROMONOSPORA PURPUREA VAR.VIOLACEA - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ГЕНТАМИЦИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНТАМИЦИНА Российский патент 1995 года по МПК C12P19/50 C12P19/50 C12R1/31 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения гентамицина.

Гентацимин антибиотик широкого спектра действия, одним из ценных свойств которого является высокая активность в отношении палочки сине-зеленого гноя.

Известно использование штамма Micromonospora purpurea ТСС 31849 для получения гентамицина, активность штамма 400-500 мкг/мл (установлена расчетным путем) [1] Отмеченный уровень активности является недостаточным для получения гентамицина промышленным путем.

Целью изобретения является повышение выхода гентамицина в процессе ферментационного получения этого терапевтически ценного антибиотика.

Цель достигается получением нового высокопродуктивного штамма Micromo- nospora purpurea var. violacea 5309/5АБ, который получен из штамма Mocromonospora purpurea var. violacea ВНИИА 7R с помощью мутагенных факторов и селективного фона.

Штамм 5309/5АБ характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Споры одиночные (0,6-0,83). Сидят на ножке-спороносце. Воздушный мицелий отсутствует.

Агар Гаузе-1. Рост хороший. Субстратный мицелий темно-пурпуровый черный (г1-А1) (Цветность дана по шкале цветов Бондарцева А.С. Издание АН СССР, М. 1954). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар Г-1 с гороховой мукой и крахмалом. Рост хороший. Субстратный мицелий серо-темно-фиолетовый грязно-буро-фиолетовый (п2-м3). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар овсяный. Рост хороший. Субстратный мицелий умбровый черный (о7-а1). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар Беннета. Рост хороший. Субстратный мицелий серо-темно-фиолетовый ржавый (н2-ж1). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар кукурузный N 6. Рост хороший. Субстратный мицелий серо-темно-фиолетовый бледно-терракотовый (н2-ж4); Растворимый пигмент отсутствует.

Агар Гаузе-2. Рост хороший. Субстратный мицелий от бледно-терракотового буровато-красного до темно-пурпурового (ж4-в1-г1). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар-тирозиновый. Рост очень слабый. Субстратный мицелий бледно-сероватый (а6). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар Эмерсона. Рост отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Оптимум роста 32-37^оС. Молоко не пептонизирует и не коагулирует. Желатин не разжижает. Крахмал гидролизует.

Отношение к источникам углерода. Усваивает крахмал, глюкозу, сахарозу, мальтозу, арабинозу, ксилозу; слабо галактозу, фруктозу; очень слабо рафинозу, лактозу; не усваивает маннит, инозит, рамнозу.

Культивирование на кукурузной агаризованной среде N 6 с 200 мкг/мл стрептомицин-сульфата. Рост отсутствует.

Культивирование на среде Г-1 с гороховой мукой и крахмалом с 6000-8000 мкг/мл сизомицин-сульфата. Рост удовлетворительный.

Антагонистические свойства. Продуцент антибиотка гентамицина, активного по отношению к большинству грамположительных и грамотрицательных бактерий, обладающего высокой активностью по отношению к палочке сине-зеленого гноя.

На среде следующего состава, крахмал картофельный 5,0; мука соевая 3,0; аммоний сернокислый 0,35; натрий хлористый 0,3; мел 0,7; кобальт хлористый шестиводный 0,00008; вода водопроводная, рН натуральный, в колбах Эрленмейера емкостью 0,75 л с 0,05 л среды средняя активность штамма 5309/5АБ на 120 ч составляет 1407 мкг/мл, максимальная 1700 мкг/мл, средняя активность штамма на 144 ч (полный ферментационный цикл) составляет 1600 мкг/мл, максимальная 1928 мкг/мл.

Известен способ получения гентамицина с использованием штамма-продуцента Micromonospora purpurea АТСС 31849 [1] Способ заключается в засеве споровым материалом штамма Micromonospora purpurea АТСС 31849 посевной среды, содержащей, мясной экстракт 0,3; триптон 0,5; декстроза 0,1; растворимый крахмал 2,4; дрожжевой экстракт 0,5; мел 0,4; вода, с последующей ферментацией на среде, содержащей, глюкоза 2; соевая мука 0,75; цветы зверобоя 0,4; мел 0,4; кобальт хлористый шестиводный 0,0001; пеногаситель 0,01; вода. Ферментацию осуществляют при аэрации в течение 140 ч. После выделения и очистки из 10 л культуральной жидкости получают 1,98 г целевого продукта (с учетом потерь на выделении активность культуральной жидкости составляет 400-500 мкг/мл).

Недостатками известного способа являются низкий выход целевого продукта и использование в качестве сырья для питательной среды мясного экстракта.

Целью изобретения является повышение уровня биосинтеза гентамицина.

Это достигается использованием при биосинтезе нового, более продуктивного штамма Micromonospоra purpureа var. violacea 5309/5АБ, новых питательных сред, а также выращиванием вегетативного посевного материала в 2 ступени.

Способ заключается в следующем.

Выращивают вегетативный посевной материал штамма 5309/5АБ (I ступень маточные колбы). При этом споры штамма вносят в колбы Эрленмейера емкостью 0,5 л с 0,05 л среды следующего состава, крахмал картофельный 2,4-2,6; мука гороховая 1,0-1,2; кукурузный экстракт (техн. вес) 0,6-0,8; мел 0,4-0,5; вода остальное, рН натуральный. Колбы встряхивают на качалке с 230-240 об/мин в течение 40-42 ч при 33^оС.

Выращивают вегетативный посевной материал (II ступень, рабочие колбы). При этом вегетативный посевно материал, выращенный на I ступени, вносят в колбы Эрленмейера емкостью 0,75 л с 0,05 л среды следующего состава, крахмал картофельный 2,4-3,5; глюкоза 0,15-0,3; мука соевая 1,5-2,5; сульфат аммония 0,25-0,32; натрий хлористый 0,25-0,35; мел 0,4-0,6; кобальт шестиводный 0,00006-0,00016, вода остальное, рН натуральный. Колбы встряхивают на качалке с 230-240 об/мин в течение 40-44 ч при 33^оС. Используя вегетативный посевной материал, выращенный на II ступени, засевают колбы емкостью 0,75 л с 0,045 л ферментационной среды следующего состава, крахмал картофельный 4,5-5,2; глюкоза 0,15-0,3; Мука соевая 3,2-4,0; сульфат аммония 0,15-0,3; натрий хлористый 0,24-0,35; мел 0,5-0,8; кобальт хлористый шестиводный 0,00008-0,0002; вода остальное, рН натуральный. Ферментацию проводят при 33^оС. Колбы встряхивают на качалке с 230-240 об/мин, продолжительность ферментации до 144 ч. Способ позволяет получить культуральную жидкость с концентрацией гентамицина в конце ферментации 2100 мкг/мл.

Особенностью способа является использование нового штамма N 5309/5АБ и измененных составов посевной и ферментационной сред, что позволяет увеличить уровень биосинтеза гентамицина.

П р и м е р 1. Споровый материал культуры Micromonospora purpurea var. violancea 5309/5АБ засевают в колбы Эрленмейера (маточные колбы емкостью 0,75 л с 0,05 л питательной среды следующего состава, крахмал картофельный 2,4; мука гороховая 1,0; кукурузный экстракт (техн. вес) 0,6; мел 0,4; вода водопроводная, рН натуральный. Колбы встряхивают на качалке с 230-240 об/мин при 33^оС в течение 42-44 ч. Вегетативный посевной материал из маточной колбы переносят в колбы емкостью 0,75 л с 0,05 л среды следующего состава, крахмал картофельный 2,5; глюкоза 0,15; мука соевая 1,5; сульфат аммония 0,25; натрий хлористый 0,25; мел 0,4; кобальт хлористый шестиводный 0,00006; вода остальное, рН натуральный. Колбы встряхивают на качалке при 33^оС 40-44 ч. Посевной материал из рабочих колб переносят в колбы емкостью 0,75 л с 0,05 л ферментационной среды следующего состава, крахмал картофельный 5,0; глюкоза 2,0; мука соевая 3,0; сульфат аммония 0,3; мел 0,7; натрий хлористый 0,3; кобальт хлористый шестиводный 0,00008; вода водопроводная; рН натуральный. Вносят 10% посевного материала от объема ферментационной среды. Биосинтез проводят при 33^оС на качалке с 230-240 об/мин. Длительность процесса биосинтеза 144 ч. Активность на 120 ч ферментации 1700 мкг/мл. Активность на 144 ч 1920 мкг/мл.

П р и м е р 2. Выращивание вегетативного материала (N 1) на среде следующего состава, крахмал картофельный 2,6; мука гороховая 1,2; кукурузный экстракт 0,8; мел 0,5, вода остальное, рН натуральный. Колбы встряхивают на качалке при 33^оС в течение 40-42 ч. Посевной материал из маточной колбы в количестве 10% от объема среды в рабочей колбе передают в колбу с посевной средой состава, крахмал картофельный 2,5; глюкоза 0,15; мука соевая 1,5; сульфат аммония 0,25; натрий хлористый 0,25; мел 0,4; кобальт хлористый шестиводный 0,00006; вода остальное, рН натуральный. Колбы встряхивают в течение 40-44 ч. Посевной материал из рабочей колбы передают в колбу емкостью 0,75 л с 0,045 л ферментационной среды следующего состава, крахмал картофельный 4,5; глюкоза 0,15; соевая мука 3,2; (NH₄)₂SO₄ 0,15; натрий хлористый 0,25; мел 0,5; кобальт хлористый шестиводный 0,0008; вода водопроводная, рН натуральный, засев ферментационной среды 10% посевного материала от объема среды. Колбы инкубируют на качалке с 230-240 об/мин в течение 144 ч. Активность на 120 ч ферментации составляет 1700 мкг/мл, на 144 ч 1980 мкг/мл.

П р и м е р 3. Выращивание вегетативного материала в маточных колбах по примеру 1. Посевной материал из маточной колбы передается в количестве 10% в рабочую колбу емкостью 0,75 л с 0,05 л посевной среды со следующим соотношением компонентов, крахмал картофельный 3,0; глюкоза 0,2; соевая мука 2,0; сульфат аммония 0,3; натрий хлористый 0,3; мел 0,5; кобальт хлористый шестиводный 0,00008, вода водопроводная, рН натуральный. Условия культивирования по примеру 2. Посевной материал из рабочей колбы в количестве 10% передается в колбу емкостью 0,75 л с 0,45 л ферментационной среды со следующим соотношением компонентов, крахмал картофельный 5,0; глюкоза 0,2; соевая мука 3,5; сульфат аммония 0,2; натрий хлористый 0,3; мел 0,7; кобальт хлористый 0,00016, вода водопроводная, рН натуральный.

Условия культивирования по примеру 2. Активность на 120 ч ферментации составляет 1750 мкг/мл, на 144 2100 мкг/мл.

П р и м е р 4. Выращивание вегетативного посевного материала в маточных колбах по примеру 1. Посевной материал из маточной колбы в количестве 10% передается в рабочую колбу емкостью 0,75 л с 0,05 л посевной среды со следующим соотношением компонентов, крахмал картофельный 3,5; глюкоза 0,3; соевая мука 2,5; сульфат аммония 0,32; натрий хлористый 0,35; мел 0,6; кобальт хлористый 0,00016; вода водопроводная, рН натуральный. Условия культивирования по примеру 2. Посевной материал из рабочей колбы в количестве 10% передается в колбу емкостью 0,75 л с 0,45 л ферментационной среды со следующим соотношением компонентов, крахмал картофельный 5,2; глюкоза 0,3; соевая мука 4,0; сульфат аммония 0,3; натрий хлористый 0,35; мел 0,8; кобальт хлористый шестиводный 0,0002; вода водопроводная, рН натуральный. Условия культивирования по примеру 2. Активность на 120 ч ферментации составляет 1745 мкг/мл, на 144 2050 мкг/мл.

Использование:биотехнология, производство антибиотика гентамицина. Сущность изобретения: вегетативный инокулум культуры штамма-продуцента Micromonospora purpurea var violacea, задепонированный в коллекции ВНИИА, под N 1931 выращивают в две стадии, причем на первой стадии используют водную питательную среду, содержащую, %: крахмал картофельный 2,4 - 2,6; мука гороховая 1,0 - 1,2; кукурузный экстракт 0,6 - 0,8; мел 0,4 - 0,5; а на второй стадии - водную питательную среду, содержащую, %: крахмал картофельный 2,5 - 3,5; глюкоза 0,15 - 0,3; мука соевая 1,5 - 2,5; сульфат аммония 0,25 - 0,32; натрий хлористый 0,25 - 0,35; мел 0,4 - 0,6, кобальт хлористый шестиводный 0,00006 - 0,00016, а ферментацию штамма проводят на питательной среде следующего состава, %: крахмал картофельный 4,5 - 5,2; глюкоза 0,15 - 0,3; мука соевая 3,2 - 4,0; сульфат аммония 0,15 - 0,3; натрий хлористый 0,25 - 0,35, мел 0,5 - 0,8, кобальт хлористый шестиводный 0,00008 - 0,0002, вода остальное. Концентрация гентамицина в культуральной жидкости достигает 2100 мкг/мл. 2 с.п. ф-лы.

1. Штамм Micromonospora purpurea var. violacea ВНИИА N 1931 - продуцент антибиотика гентамицина. 2. Способ получения гентамицина путем выращивания вегетативного инокулума продуцента культуры Micromonospora purpurea в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующей инокуляцией ферментационной среды, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью повышения концентрации целевого продукта в культуральной жидкости, в качестве продуцента используют штамм Micromonospora purpurea var. violacea ВНИИА N 1931, выращивание вегетативного инокулума осуществляют в две стадии, причем на первой стадии используют водную питательную среду, содержащую, картофельный крахмал 2,4 - 2,6, муку гороховую 1,0 1,2, кукурузный экстракт 0,6 0,8, мел 0,4 0,5, на второй стадии водную питательную среду, содержащую крахмал картофельный 2,5 3,5, глюкозу 0,15 0,3, муку соевую 1,5 2,5, сульфат аммония 0,25 - 0,32, натрий хлористый 0,25 0,35, мел 0,4 0,6, кобальт хлористый шестиводный 0,00006 0,00016, а ферментацию проводят на среде следующего состава, крахмал картофельный 4,5 5,2, глюкоза 0,15 0,3, мука соевая 3,2 4,0, сульфат аммония 0,15 0,3, натрий хлористый 0,25 0,35, мел 0,5 - 0,8, кобальт хлористый шестиводный 0,00008 0,0002, вода остальное.