Штамм @ @ @ @ @ . @ . Советский патент 1986 года по МПК C12P1/02 C12P1/02 C12R1/29 

Изобретение относится к медицине и касается получения антибиотиков. Известен штамм Micromonospora inyoensis NRRZ 3292 - продуцент сизомицина. Недостатком данного штамма является низкий уровень активности культуральной жидкости. Цель изобретения - повьшенне активности культуральной жидкости. Поставленная цель достигается путем использования штамма Micromonoaрога fusca var. sisomycini var. now 15-72. Штамм Micromonospora fusca var. sisomycini var. nov. 15-72,выделен из лугово-каштановой оглееной почвы Крыма в районе Саки, депонирован и хранится в коллекции культур Всесоюзного научно-исследовательского института под номером 15-72 и харак теризуется следующими культуральноморфологическими, физиолого-биохими ческими и антибиотическими свойства ми. Культурально-морфологические при наки. Спороносцы отходят от веток субстратного мицелия. Воздушный мицелий не образуется. Споры круглые с бугристой поверхностью, размером 0,8-1, , располагаются на конце коротких спороносцев, часто образуя грозди. хорошо развивается на боль шинстве агаризованных сред. Субстратный мицелий оранжево-ржавый до коричнево-черного цвета. Растворимы пигмент на большинстве сред отсутст вует. На соевой агаризованной среде образуется умбровьй пигмент. Среда Чапека. 20 дней выращивания при . Рост удовлетворительный. Колонии оранжево-ржавые (М-1) до темно-коричневых (Л-5). Здесь и далее окраска определена по таблице цветов Бондарцева. 1951 .г. Растворимьй пигмент отсутствует. Глюкозо-аспарагиновый агар. 20 дней выращивания при 28°С. Рост хоро ший. Колонии темно-каштановые (0-7). Растворимьй пигмент отсутствует. Крахмальный агар с растворимым крахмалом. 20 дней выращивания при 20°С. Рост обильный. Колонии темнокаштанового до буро-красного цвета (0-7 - В-1). Растворимый пигмент отсутствует . 02 . Минеральная среда № 1 Гаузе. 20 выращивания при 28°С. Рост обильный. Колонии гнедые до черного цвета (В-2 - А-1). Растворимый пигмент отсутствует. Агар Беннета. 20 дней выращивания при 28°С. Рост обильный. Колонии коричневого до черного цвета (Л-5 - А-1). Растворимый пигмент отсутствует. Овсяной агар. 20 дней вьфащивания при . Рост обильный. Колонии темно-каштанового до ржавого цвета (0-7 - Ж-1). Растворимьй пигмент отсутствует. Мясо-пептонньш агар. 20 дней выраш;ивания при 28°С. Рост отсутствует. Агар с тирозином. 20 дней вьфапщвания при . Рост слабый. Пигмент отсутствует. Соевый агар. 20 дней выращивания при 28С. Рост обильньш. Колонии темно-каштанового цвета с металлическим блеском (0-7). Растворимьй пигмент умбрового цвета (П-2). Ломтики картофельные. 20 дней выращивания при 28°С. Рост хороший. Колонии черные. Растворимый пигмент отсутствует. Культура сохраняется на агаризованных средах под слоем вазелинового масла, на скошенном агаре при 5°С в течение 6 мес. Физиолого-биохимические признаки. Оптимальная температура роста 26-34°С. При 50°С не растет. Л латину разжижает зт еренно (1421 день). Молоко коагулирует быстро (5-7 день). Крахмал гидролизует умеренно (14 дней). . Меланиды не образует (агар Треенера с лимоннокислым железом). Использование различных источников углерода (среда Придхе ма-Готтлиба). Хорошо растет в присутствии сахарозы, маннита и крахмала. Очень слабо - в присутствии галактозы. Не растет в присутствии арабинозы, лактозы, рамнозы, ксилозы, раффинозы, инозита и сорбита. Антибиотические свойства. Культура 15-72 при культивировании в жидкой питательной среде в колбах на качалках (в ферментерах) на 4-5 сутки образует антибиотик, подав3ляющий рост различных штаммов грампо ложительных и грамотрицательных бактерий (Staph.. aureus,Bac, subtilis, Вас. mycoides,Mycdbac teriura pulli, Sarcina lutea, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus Vulgaris. Comamo nas terrigena, Providencia stuartii) и не задерживает рост дрожжей имице лиальных грибов Candida allicans, Saccharomyces cerevisiae, Torula utilis, Aspergillus niger, Penicillium notatum. Ha 10-12 сутки роста культура образует противоопухолевой антибиотик который обладает действием in vitro только в отношении грамположительных бактерий, а in vivo подавляет рост ряда экспериментальных опухолей. Пример 1. Агаровым блоком из 10-14 суточной культуры Micromonospora vac. sisomycini var. nov. 15-72, выращенных на минеральной среде Гаузе № 1, засевают маточную колбу с посевной средой следующегосостава, %: Кукурузный экстракт 1 (технич. Сернокислый аммоний 0,35 Крахмал1,5 ГлюкозаI Хлористый натрий 0,5 Углекислый кальций 0,5 Значение рН среды 7,0, обьем сре ды в колбах 100 мл; выращивание на качалках при 280 об/мин при 34°С в течение 72 ч. Мицелий из, маточной колбы переносят в посевные колбы со 100 мл среды указанного состава. Культивирование посевных колб ведут так же, как и маточных. Мицелий из посевных колб используют в качестве инокулята при биосинтезе сизомицина в ферментерах или.в колбах. Инокуля может быть получен также в фермент рах-инокуляторах. Для ферментации используют среду следующего состава, %: Соевая мука 3 Крахмал4,5 Сахароза2 Натрий азотнокислый 1 Кальций углекислый 0,5 Кобальт хлористый 0,8 мг/л Значение рН среды 7,0. А). Ферментация на качалках: 96 120 ч, 280 об/мин, 34°С, получают культуральную жидкость с содержание 270 мкг/мл сизо.мицина. 4 Б). Биосинтез в ферментерах: засев в ферментерах производят.инокулятом, взятым в количестве 10% от объема ферментационной среды, ферментацию ведут при 34°С в течение 96-120 ч, получают культуральную жид кость с содержанием 270-300 мкг/мл сизомицина. По окончании ферментации 50 мл культуральной жидкости подкисляют щавелевой кислотой до рН 1,5-2,0, перемешивают 30 мин и фильтруют. Фильтрат культуральной жидкости нейтрализуют водным раствором аммиака до рН 6,5-7,5. 45 л нейтрализованного фильтрата культуральной жидкости пропускают через колонку с 250 мл катионита КБ-2 в аммонийной форме. По окончании сорбции колонку промывают водой и десорбируют сизомицин 2 н. водным раствором аммиака. Получают 600 мл элюата, который упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в минимальном количестве воды, подкисляют разбавленной серной кислотой до рН 4,0-4,5, осветляют раствор активированным углем и осаждают из раствора сульфат добавлением 10-кратного количества метанола. Получают 24 г препарата с содержанием около 360 мкг/мг сизомицина основания (8,6 г в пересчете на основание сизомицина) . Неочищенный сульфат растворяют в минимальном количестве воды и вносят в колонку с 800 мл анионита . Антибиотик вымывают дистиллированной водой. Элюат упаривают досуха. Остаток растворяют в смеси изопропанол-хлороформ-. 25%-ный аммиак (1:1:1 ниJкняя фаза), вносят в колонку с 500 г силикагеля марки КСК (или водной кремневой кислоты) и хроматографируют в той же системе. Фракции, содержащие сизомицин, объединяют, упаривают досуха. Остаток растворяют в минимальном количестве воды, раствор подкисляют разбавленной серной .кислотой до рН 4,5, осветляют активированным углем. Сульфат сизомицина осаждают добавлением к раствору 10-кратного количества метанола. Получают 7,8 г сульфата сизомицина с содержанием 600 мктУмл основания сизомицина (в пересчете на основание 4,8 г). П р и м е р 2. Агаровым блоком из 10-14 суточной культуры Micromonospora fusca var. sisomycini var. nov, 15-72 засевают маточную колбу с посевной средой следующего состава, %-. Кукурузный экстракт 0,7 (техни вес) Крахмал2,5 Углекисльй кальций 0,8 Сернокисльй аммоний 0,35 Хлористый на;трий 0,5 Значение рН среды 7,0, .объем сред в колбах 100 мл; выращивание на качалках при 280 об/мин при 34 С в те чение 72 ч. Мицелий из маточных кол переносят в посевные колбы с 100 мл среды.указанного состава. Культивирование посевных колб ведут так же, как и маточных. Мицелий из посевных колб ргспользуют в качестве инокулят при биосинтезе сизомицина в ферментерах или в колбах. Инокулят может быть получен- в ферментерах-инокуляторах. Для ферментации используют среду следующего состава: Соевая мука Крахмал 2,5% . Сахароза 1% (технич Кукурузный экстракт Натрий хлористый Кальций углекислый 1,5 мг/л Кобальт хлористьй Значение рП среды 7,0. А). Ферментация на качалках: в колбы на 750 idn наливают по 50 .мл среды,- засевают по 5 мл инокулята, биосинтез ведут при 34°С в течение 72-96 ч, получают культуральную жид кость с coдepkaниeм 320 мкг/мл сизо мицина . Б), Биосинтез в ферментерах: засев производят инокулятом, взятьм в количестве 10% от объема фермента ционной среды, ферментацию ведут пр 34°С 72-96 ч. Получают культуральну жидкость с содержанием 320 мкг/мл сизомицина. По окончании ферментации 50 л культуральной жидкости подкисляют щавелевой кислотой до рН 1,5-2,0, перемешивают 30 мин и фильтруют. Фильтрат культуральной жидкости нейтрализуют водным раствором аммиака до рН 6,5-7,5. 45 л нейтрализованного фильтрата культуральной жи,дкости пропускают через колонку с 250 мл катионита КБ-2 в натриевой форме. По окончании сорбции колонку промывают водой и десорбируют сизомицин 1 .н. водным раствором серной кислоты. Элюат нейтрализуют анионитом ЭДЭ-10 в ОН форме до рИ 6,5-7,0, затем перемешивают с углем в течение 30 мин, уголь отфильтровывают. Фильтрат пропускают через колонку с 150 мл катио- нита КУ-2-20 в Н форме, колонку промывают водой, объединенные элюаты нейтрализуют анионитом ЭДЭ-1, в ОН форме до рН 6,5-7,0. Нейтрализованные элюаты упаривают при пониженном давлении до небольшого объема, подкисляют 10%-ной серной кислотой до рН 4,0-4,5, добавляют активированньй уголь, перемешивают 20 мин, после чего уголь отфильтровывают. Фильтрат выливают в 10-кратное количество метанола. Выпавший осадок сульфата сизомицина отфильтровьшают. Получают около 20 г препарата с содержанием 360 мкг/мг сизомицина основания 7,2 г в пересчете на основание сизомицина) . Предлагаемый штамм Micromonospora Eusca var. sisomycini var. nov. 15-72 при ферментации на одной из оптимальных сред позволяет получить 7,5-8,0 г сизомицина сульфата, содержащего около 600 мкг/мг сизомицина основания из 50 л культуральной жидкости.

ШТАММ KICROMONOSPORA FUSCA 'VAR. SIS01JIYCINI VAR. NOV. 15-72-ПРО- ДУЦЕНТ СИЗОМИДИНА, хранится в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков под номером 15-72 и характеризуется следующими культурально-морфологи- ческими, физиолого-биохимическими и антибиотическими свойствами.Культурально-морфологические признаки. Спороносны отхо'дят от веток субстратного мицелия. Воздушный мицелий не образуется. Споры круглые с бугристой поверхностью, размером 0,8-1,0р, располагаются на конце коротких спороносцев, часто образуя гро.зди.'Среда Чапека. Рост удовлетворительный. Колонии оранжево-ржавые до темно-коричневого. Растворимый пигмент отсутствует.Минеральная среда № 1 Гаузе. Рорт обильный. Колонии гнедые до черного цвета. Растворимый пиг^^ент отсутствует.Агар Беннета. Рост обильньй. Колонии коричневого до черного цвета. Растворимый пигмент отсутствует.Овсяной агар. Рост обильный. Колонии темно-каштанового до ржавого цвета. Растворимьй пигмент отсутствует.Соевый агар. Рост обильный. Колонии темно-каштанового цвета с металлическим блеском. Растворимый пигмент умбрового цвета.Ломтики картофеля. Рост хороший. Колонии черные. Растворимый пигмент . отсутствует.Физиолого-биохимические признаки. . Оптимальная температура роста 26-34''С. При 50''С не растет. Желатину разжижает умеренно.Молоко коагулирует быстро.Крахмал гидролизует умеренно.Меланиды не образует.Отношение к углеводам.^Усваивает хорошо сахарозу, маннит, крахмал, слабо галактозу. Не усваивает араби- нозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, раф- .финозу, инозит, сорбит.Антибиотические свойства.Подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий Staph.aureus. Вас. subtilis. Вас. raycoi- des, Mycobacterium pulli, Sarcina. lutla, E. coli, Pseudomona aerugino- sa, Proteus vulgaris, Comamonas ter- rigena, Providencia\stuartii.(Л^CO^