КРИОПРОТЕКТОР ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК Российский патент 1995 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к медицине, биологии и касается криопротекторов животных клеток.

Цель изобретения расширение арсенала криопротекторов животных клеток, обеспечивающих получение более высокого процента жизнеспособных клеток после их размораживания.

Для этого используют ламинарин или продукт его ферментативной трансформации транслам в качестве криопротектора животных клеток. В присутствии этих β-1,3; 1,6-глюканов сохраняются жизнеспособными от 60 до 90% животных клеток после их размораживания. Кроме высоких криопротекторных свойств важным достоинством ламинарина или продукта его ферментативной трансформации транслама является то, что эти глюканы, как вещества с высокой молекулярной массой (М. М. 5000 и 8000), не проникают внутрь клетки. Как показали эксперименты, эти вещества не токсичны для клеток в концентрации 100 мг/мл в течение 2 ч после их введения без замораживания клеток, а также в течение 2 ч после размораживания клеток, замороженных в присутствии глюканов.

Транслам получают путем ферментативного гидролиза ламинарина и применяют как иммуностимулятор [1]
Криопротекторную активность ламинарина или транслама определяют по жизнеспособности животных клеток после их замораживания и размораживания по стандартной методике [2] В качестве модели используют клетки мышиной карциномы Эрлиха в стационарной фазе роста на 8-9 день после инокуляции.

П р и м е р 1. Применение ламинарина в качестве криопротектора животных клеток.

Клетки мышиной карциномы Эрлиха трижды промывают на холоду фосфатно-солевым буфером (ФСБ), рН 7,4. Исходную суспензию клеток готовят в культуральной среде, состоящей из среды Игла и 300 мкг/мл глютамина. Суспензию клеток разливают по 50 мкл в 96-луточную микроплату "Limbro" и добавляют 50 мкл раствора ламинарина в ФСБ в конечных концентрациях 12,5; 25 и 50 мг/мл. В качестве контроля на микроплату наносят 50 мкл ФСБ, а в качестве положительного контроля 50 мкл сахарозы в тех же конечных концентрациях. Суспензию клеток с криопротекторами перемешивают. Затем плату помещают в пенопластовый контейнер и ставят в холодильник на -20^оС. Через 16 ч плату помещают на 20 мин в сухой термостат при 37^оС. После размораживания клеток проводят оценку их жизнеспособности методом окрашивания трипановым синим. Оказалось, что в суспензии, не содержащей криопротектора, жизнеспособных клеток нет. В присутствии же в суспензии ламинарина сохраняется 60% жизнеспособных клеток, а в присутствии сахарозы сохраняется 50% жизнеспособных клеток.

П р и м е р 2. Применение транслама в качестве криопротектора животных клеток.

Получение, замораживание и размораживание клеток проводят как описано в примере 1. В качестве добавки в культуральную среду вводят 50 мкл раствора транслама в ФСБ в конечных концентрациях 12,5; 25 и 50 мг/мл. В качестве контроля на микроплату наносят 50 мкл ФСБ, а в качестве положительного контроля 50 мкл глюкозы в тех же конечных концентрациях. Оценка жизнеспособности клеток после размораживания клеток показала, что в контроле в отсутствии криопротектора жизнеспособных клеток нет. Использование в качестве криопротектора транслама позволяет сохранить жизнеспособными до 90% клеток, тогда как использование глюкозы сохраняет жизнеспособными только 50% клеток.

Результаты определения жизнеспособности клеток мышиной карциномы Эрлиха после их замораживания и размораживания представлены в таблице.

Как видно из таблицы, при использовании одинаковых с сахарозой и глюкозой концентраций (50 мг/мл) применение в качестве криопротектора ламинарина дает лучшие на 10% а транслама на 40% лучшие результаты.

П р и м е р 3. Применение транслама в смеси с 4%-ным глицерином в качестве криопротектора животных клеток.

Получение, замораживание и размораживание клеток проводят как описано в примере 1. В культуральную среду вводят 50 мкл смеси транслама и 4%-ного глицерина в ФСБ. Концентрацию глицерина не изменяют, а транслам вводят в конечной концентрации 1,5-12,5 мг/мл.

На чертеже представлены результаты определения жизнеспособности клеток после замораживания и размораживания.

В качестве криопротекторов в культуральную среду вводили: 1 глицерин в ФСБ в конечной концентрации 4% 2 транслам в ФСБ в конечной концентрации 12,5 мг/мл; 3 глицериновый препарат транслама 14% глицерин и транслам в ФСБ в разных конечных концентрациях 1,5-12,5 мг/мл).

Как видно из чертежа, в сочетании с 4%-ным глицерином транслам сохраняет более 50% жизнеспособных клеток, начиная с концентрации 1,5 мг/мл, а в концентрации 12,5 мг/мл сохраняет жизнеспособными 80-90% клеток. Кроме того, оба глюкана не проникают в клетки и не токсичны для них.

Использование: медицина, биология. Сущность изобретения заключается в применении ламинарина или продукта его ферментативной трансформации - транслама в качестве криопротектора животных клеток. В присутствии этих β-1,3; 1,6-глюканов сохраняются жизнеспособными от 60 до 90% животных клеток после их размораживания. Кроме высоких криопротекторных свойств важным достоинством ламинарина или продукта его ферментативной трансформации - транслама является то, что эти вещества не проникают внутрь клетки и не токсичны. 1 ил., 1 табл.

Применение траслама в качестве криопротектора животных клеток.