ПРОИЗВОДНЫЕ 5`-БЕНЗОИЛГУАНОЗИНА В КАЧЕСТВЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ НЕОБРАТИМЫХ ИНГИБИТОРОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C07H19/167 C12N9/99 

Изобретение относится к новым химическим соединениям производным 5'-бензоилгуанозина общей формулы
R-O где R BrCH₂- (I) или N- (II), в качестве специфических необратимых ингибиторов РНК-полимеразы.

Описываемые соединения могут быть использованы в биохимии, биофизике и молекулярной биологии для специфического необратимого ингибирования РНК-полимеразы и изучения строения и механизма действия данного фермента.

Известен 5'-[4-(фторсульфонил)бензоил]гуанозин [1] Однако действие данного соединения на РНК-полимеразу не изучено.

Наиболее близким к предлагаемому является соединение 5'[4-(фторсульфонил)бензоил]аденозин, который оказывает специфическое необратимое ингибирующее действие на РНК-полимеразу [2] Однако данное соединение оказывает недостаточно эффективное ингибирующее действие не фермент.

Целью изобретения является создание новых соединений в ряду 5'-бензоилпроизводных пуриновых нуклеозидов, оказывающих более эффективное ингибирующее действие на РНК-полимеразу.

Указанная цель достигается производными 5'-бензоилгуанозина приведенной общей формулы I в качестве специфических необратимых ингибиторов РНК-полимеразы.

Описываемые соединения указанной общей формулы I получают способом, основанным на известной реакции селективного ацилирования 5'-гидроксильной группы гуанозина хлорангидридом соответствующей 4-замещенной бензойной кислоты в среде гексаметилтриамида фосфорной кислоты (безводного) в отсутствие основания.

П р и м е р 1. 5'-[4-(бромметил)бензоил]гуанозин (I). К раствору 160 мг (0,5 ммоль) гидрохлорида гуанозина в 1,5 мл безводного гексаметилтриамида фосфорной кислоты добавляют 210 мг (0,9 ммоль) 4-(бромметил)бензоилхлорида. Реакционную смесь перемешивают 15 ч при комнатной температуре, защищая от доступа влаги, затем экстрагируют гексаном (3 х 8 мл). Нижний слой отделяют, смешивают с 2 мл безводного этанола и высаживают целевой продукт добавлением 7 мл охлажденного безводного диэтилового эфира. Выделившийся осадок затирают со смесью безводный этанол безводный диэтиловый эфир (1:3) до кристаллического состояния, осадок отделяют центрифугированием, суспендируют в 1 мл холодной воды, повторно центрифугируют (при необходимости данную операцию повторяют), затирают с указанной смесью. После чего полученный осадок очищают переосаждением из безводного этанола безводным диэтиловым эфиром. Получают 82 мг целевого продукта (выход 34%). Т. пл. 213-216^оС (с разл.).

Данные элементного анализа:
Вычислено, мас. C 45,01; H 3,79; N 14,58; C₁₈H₁₈BrN₅O₆.

Найдено, мас. C 45,29; H 3,86; N 14,49.

УФ-спектр (диоксан-вода, 1: 4, об. ); λ_max^рН7, нм (ε, М^-1 см^-1): 244 (19200); пл. 275 (4800).

ИК-спектр (KBr), ν, см^-1: 1720 (C=O).

Соединение охарактеризовано хроматографической подвижностью при тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol" в системе н-бутанол уксусная к-та вода (5:2:3, об.) (А): R 0,64; в системе н-бутанол вода (85:15, об.) (Б): R 0,51.

П р и м е р 2. 5'-[4-(2,5-дигидро-2,5-диоксопирролил-1)бензоил]гуанозин (II). В условиях примера 1 из 160 мг (0,5 ммоль) гидрохлорида гуанозина и 232 мг (1 ммоль) 4-(2,5-дигидро-2,5-диоксопирролил-1)бен-зоилхлорида получают 99 мг целевого продукта (выход 41%). Т. пл. 259-262^оС (с разл.).

Данные элементного анализа:
Вычислено, мас. C 52,28; H 3,77; N 17,43; C₂₁H₁₈N₆O₈.

Найдено, мас. C 52,05; H 3,62; N 17,51.

УФ-спектр (диоксан-вода, 1: 4, об. ), λ_max^рН7, нм (ε, М^-1 см^-1): 252 (15300).

ИК-спектр (KBr), ν, см^-1: 1710 (C=O).

R 0,47 (А); 0,23 (Б).

Изучение ингибирования РНК-полимеразы описываемыми соединениями проводили следующим образом.

ДНК-зависимую РНК-полимеразу фага Т7 выделяли из штамма-продуцента E.coli известным способом. Активность фермента определяли по образованию (³²Р)-РНК из (³²Р)-нуклеозид-5'-трифосфатов.

Смесь для инкубации фермента ингибитором (общий объем 10 мкл) содержит 50 мМ трис-HCl (рН 7,8); 10 мМ MgCl₂; 5 мМ LiCl; 10 мМ меркаптоэтанол; фермент 0,2-0,5 мкг в пробе; изучаемое соединение в виде 10 мМ раствора в диметилформамиде вносят в среду для получения раствора требуемой концентрации (0,4 мМ). Преинкубацию проводят при комнатной температуре. Через определенные промежутки времени (от 5 до 30 мин) к пробам добавляют по 15 мкл смеси, содержащей (в том же буферном растворе): плазмиду pGEM-2 ("Promega Biochem. ", США) 20-40 мкг/мл; аденозин-5'-трифосфат (АТФ), уридин-5'-трифосфат (УТФ), цитидин-5'-трифосфат (ЦТФ) и гуанозин-5'-трифосфат (ГТФ) по 0,4 мкмоль/мл; ( α-³²Р)-УТФ (200000 имп./мин на пробу). Реакцию проводят при 37^оС в течение 20 мин. Определение количества образовавшейся РНК (кислотонерастворимого материала) проводят известным способом.

Значение k_каж. определяют из графика зависимости ln A_i/A_o от времени преинкубации t, где A_i и A_o активность фермента в присутствии и в отсутствие ингибитора соответственно (с учетом слабого ингибирующего действия диметилформамида в контрольной пробе).

Используемый препарат ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 имеет активность 130000-160000 ед. и характеризуется следующими значениями K_m для нуклеозид-5'-трифосфатов: K_mГТФ 0,16 мМ; K_mАТФ 0,04 мМ; K_mЦТФ 0,08 мМ; K_mУТФ 0,06 мМ. Инициирующим реакцию нуклеозидтрифосфатом является ГТФ.

Эффект ингибирования РНК-полимеразы описываемыми соединениями увеличивается с течением времени и не уменьшается после их удаления из среды преинкубации (диализ), что указывает на необратимое связывание ингибиторов с ферментом. При совместной преинкубации с ГТФ (субстрат РНК-полимеразы) наблюдают защитный эффект от действия ингибиторов, что указывает на их специфическое взаимодействие с активным центром фермента. Ингибирование РНК-полимеразы соединениями I и II, а также наиболее близким известным структурным аналогом 5'[4-(фторсульфонил)бензоил]аденозином (III) в концентрации 0,4 мМ охарактеризовано константами k_каж.

Для описываемых соединений I и II k_каж. 0,13 и 0,09 мин^-1 соответственно, а для известного соединения III k_каж.= 0,03 мин^-1.

Как вытекает из сравнения указанных данных, описываемые соединения оказывают более выраженное ингибирующее действие на РНК-полимеразу по сравнению с известным соединением III. Кроме того, наличие в составе молекулы соединения II малеимидного фрагмента позволяет идентифицировать SH-группу в активном центре фермента.

Изобретенеие касается нуклеозидов, в частности производных 5 бензоил-гуанозина общей формулы, где R-BrCH₂ - (I) или в качестве специфических необратимых ингибиторов РНК-полимеразы. Цель - создание нового более эффективного специфически необратимого ингибитора РНК-полимеразы. Синтез ведут селективным ацилированием гидрохлорида гуанозина в безводном гексаметилтриамиде фосфорной кислоты с помощью хлорангидрида соответствующей 4-замещенной бензойной кислоты. Для соединений I и II соответственно K=0,13 и 0,09 мин^-1, а для аналога - литиевой соли гуанозин - 5′ - (2-бромэтил) фосфоната- 0,03 мин^-1. Соединение II также позволяет идентифицировать SH-группу в активном центре фермента.

Производные 5'-бензоилгуанозина общей формулы


в качестве специфических необратимых ингибиторов РНК-полимеразы.