Изобретение относится к новым химическим соединениям - солям 3'-амидопроизводных (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(6-аминопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил- 6'-дифосфата общей формулы
где
или
Cat+ - катион щелочного металла,
в качестве специфических флуоресцентных ингибиторов миозиновой аденозин-5'-трифосфатазы (АТФазы).
Данные соединения могут быть использованы в биохимии, биофизике и молекулярной биологии для изучения строения и механизма действия миозиновой АТФазы с помощью спектрофлуориметрии.
Известно, что аденозин-5'-дифосфат оказывает специфическое ингибирующее действие на миозиновую АТФазу (Ki= ≃ 52 мкМ) [1].
Однако данное соединение не обладает флуоресцентными свойствами и оказывает недостаточно высокое ингибирующее действие на фермент.
Наиболее близким к описываемым является известное соединение -1, N6-этено-2-азааденозин-5'-дифосфат в качестве специфического флуоресцентного ингибитора миозиновой АТФазы (Ki= 26 мкМ) [2].
Однако данное соединение оказывает недостаточно эффективное ингибирующее действие на фермент.
Цель изобретения - создание новых соединений в ряду производных аденозин-5'-дифосфата, оказывающих более эффективное ингибирующее действие на миозиновую АТФазу и обладающих флуоресцентными свойствами.
Цель достигается солями 3'-амидопроизводных (1'R,5'R)-3'-аза-1'- (6-аминопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил-6'-дифосфата вышеуказанной общей формулы в качестве специфических флуоресцентных ингибиторов миозиновой АТФазы.
Соединения вышеуказанной общей формулы получают способом, основанным на известной реакции циклизации продукта периодатного окисления аденозин-5'-дифосфата с гидразидами карбоновых кислот в водно-органической среде при pH 4,5 - 5,0 [3].
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Дилитиевая соль (1'-R,5'R)-аза-1'-(6-аминопуринил- 9)-3'-дезокси-3'-(1-гидроксинафталин-2-карбоксамидо) гексопиранозитл-6'-дифосфата (1).
К раствору 52 мг (0,1 ммоль) динатриевой соли оксо-аденозин-5'- дифосфата (x 3 H2O), очищенной от примеси иодата натрия, в 5 мл 1 М литий-ацетатного буфера (pH 5,0) при перемешивании добавляют раствор 26 мг (0,13 ммоль) 1-гидроксинафталин-2-карбонилгидразина в 5 мл диметилформамида. Полученный раствор перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре, затем упаривают при пониженном давлении и температуре ≤40oC досуха, остаток растворяют в 2 мл воды, фильтруют, фильтрат упаривают в вышеуказанных условиях до объема ≃ 0,5 мл и обрабатывают 5 мл охлажденной смеси безводный этанол - безводный диэтиловый эфир (3: 1, об.) Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают безводным диоксаном, затем безводным диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме в присутствии фосфорного ангидрида. Получают 41 мг целевого продукта (выход 62%).
Физико-химические свойства полученного соединения представленны в таблице 1.
Пример 2. Дилитиевая соль (1'R,5'R)-3'-аза-1'-(6-аминопуринил-9)- 3'-дезокси-3'-(N'-[5-(диметиламино)нафталин-1-сульфонил] гидразинокарбоксамидо)гексопиранозил-6'-дифосфата (II).
В условиях, аналогичных описанным в примере 1, из 40 мг (0,13 ммоль) N'-[5-(диметиламино)нафталин-1-сульфонил] карбогидразида получают 57 мг целевого продукта (выход 70%).
Физико-химические свойства полученного соединения представлены в таблице 1.
Пример 3. Дикалиевая соль (1'R,5'R)-3'-аза-1'-(6-аминопуринил- 9)-3'- дезокси-3'-(1-гидроксинафталин-2-карбоксамидо)гексопиранозил-6'- дифосфата.
Раствор 34 мг продукта, полученного в примере 1, в 1 мл воды наносят на колонку с ионообменной смолой Дауэкс 50 х 8 (1 х 4 см, K+-форма). Целевой продукт элюируют водой, полученный раствор упаривают досуха при пониженном давлении, повторно упаривают с безводным этанолом, остаток растирают с безводным диэтиловым эфиром, отделяют и высушивают в присутствии фосфорного ангидрида. Получают 30 мг целевого продукта (выход 80%).
Физико-химические свойства полученного соединения представлены в таблице 1.
Пример 4. Динатриевая соль (1'R,5'R)-3'-аза-1'-(6-аминопуринил-9)-3'-дезокси-3'-(1- гидроксинафталин-2-карбоксамидо)гексопиранозил-6'-дифосфата.
В условиях, аналогичных описанным в примере 1, используя 2 мл 1 М натрий-ацетатного буфера (pH 5,0), получают 47 мг целевого продукта (выход 67%).
Физико-химические свойства полученного соединения представлены в таблице 1 (см. в конце описания).
Изучение ингибирования аденозин-5'-трифосфатазной активности (КФ. 3.6.1.32) соединениями I и II проводили на миозине, выделенном из скелетных мышц кролика. Активность фермента определяли по накоплению неорганического фосфата в процессе реакции, катализируемой миозиновой аденозин-5'-трифосфатазой. В состав реакционной смеси входили: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,8); 0,5 М KCl; 10 мМ CaCl2 и 2 - 4 мМ аденозин-5'-трифосфат (АТФ).
Реакцию начинали внесением в инкубационную смесь, термостатируемую при +20oC, препарата фермента до конечной концентрации 0,1 - 0,5 мг/мл и проводили 5 - 15 минут в зависимости от препарата фермента. Определение количества образовавшегося неорганического фосфата осуществляли известным способом.
Ингибирование аденозин-5'-трифосфатазной активности проводили в стандартных условиях определения активности данного фермента с добавлением в среду соединений I и II в концентрациях от 0,05 до 0,25 мМ. Эффект ингибирования наблюдали по падению аденозин-5'-трифосфатазной активности относительно пробы, не содержащей соединений I и II.
Ингибирование миозиновой аденозин-5'-трифосфатазы под действием соединений I и II охарактеризовано константами: Ki=13 и 16 мкМ соответственно.
Как указывалось выше, наиболее близким известным структурным аналогом соединений I и II является 1, N6-этено-2-азааденозин -5'-дифосфат, оказывающий специфическое ингибирующее действие на аденозин-5'-трифосфатазу (Ki= 26 мкМ) и обладающий флуоресцентными свойствами.
Как вытекает из сравнения вышеприведенных констант ингибирования, описываемые соединения оказывают более выраженное ингибирующее действие на аденозин-5'-трифосфатазу и расширяют ассортимент зондов для изучения данного фермента с помощью спектрофлуориметрии.
Источники информации.
1. R.G.Yоunt, D.Oiala, D.Babcork "Interaction of P-N-P and P-C-P analogs of adenosine triphosphate with heavy meromyosin, myosin, and actomyosin" Biоchemistry, 1971, 10 (13) 2490.
2 H.Miyata, H. Asai "1, N6 Etheno-2-azaadenosine Triphosphate: enormous iucrease in fluorescence intensity induced by its binding to heavy meromyosin and estimation of the kinetic parameters" Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1982, 105(1) 296.
3. F.Hannsske, F.Cramer "Untersuchungen zur Struktur perjodatoxydierter Ribonucleoside and Ribonucliotide" Carbohydrate Res., 1977, 54, 75.
Соли-3'-амидопроизводных (1'R, 5'R)-3'-аза-1'(6-аминопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил-6'-дифосфата формулы 1, где R - остаток формулы (а, б), Cat+ - катион щелочного металла, обладают более эффективным ингибирующим действием на миозиновую АТФазу и проявляют флуоресцентные свойства. 1 табл.
где
Соли 3'-амидопроизводных (1'R,5'R)-3'-аза-1'-(6-аминопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил-6'-дифосфата общей формулы
где
или
Cat+ - катион щелочного металла,
в качестве специфических флуоресцентных ингибиторов миозиновой аденозин-5'-трифосфатазы.
