Изобретение относится к новым химическим соединениям - литиевым солям (1R, 5'R)-3'-аза-3'-(азидонафталин-1-сульфамидо)-1'- (6-аминопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил-6'-ди- или -трифосфатов общей формулы:
где n = 2 или 3, R1 = N3 и R2 = H или R1 = H и R2 = N3 (I - IV) как специфическим фотоактивируемым необратимым ингибиторам Na,K-аденозинтрифосфатазы.
Описываемые соединения могут быть использованы в биохимии, биофизике и молекулярной биологии для специфического ингибирования Na,K-аденозинтрифосфатазы (Na,K-АТФазы), изучения строения и механизма действия данного фермента.
Известен 1, N6-этеноаденозин-5'-трифосфат в качестве специфического флуоресцентного ингибитора Na,К-АТФазы [1].
Однако данное соединение не содержит в составе молекулы реакционноспособной группировки, что существенно ограничивает возможности его применения для изучения фермента.
Известен 8-азидоаденозин-5'-трифосфат в качестве специфического фотоактивируемого необратимого ингибитора Na,K-АТФазы [2].
Однако данное соединение не обладает флуоресцентными свойствами и не позволяет проводить изучение фермента с помощью спектрофлуориметрии.
Наиболее близким к описываемым является известное соединение -3'-O-[3-(4-азидо-2-нитрофенил)пропионил] аденозин-5'-трифосфат, являющийся специфическим фотоактивируемым необратимым ингибитором Na,K-АТФазы [3].
Однако данный модификатор обладает следующими недостатками:
а) отсутствием выраженных флуоресцентных свойств у фермент-ингибиторного комплекса, получаемого на его основе;
б) значительным расстоянием между азидной группой и рибозным фрагментом молекулы, что может привести к модификации аминокислот, удаленных от активного центра фермента;
в) сложностью синтеза, связанной с использованием 3-(4-азидо-2-нитрофенил)пропионовой кислоты.
Цель изобретения - создание новых, более доступных соединений в ряду (азидоарил)производных 5'-адениловых нуклеотидов, позволяющих более эффективно проводить изучение Na,K-АТФазы с помощью спектрофлуориметрии.
Цель достигается литиевыми солями (1'R,5'R)-3'-аза-3'-(азидонафталин-1-сульфамидо)-1'-(6-аминопуринил- 9)-3'-дезоксигексопиранозил-6'-ди- или трифосфатов вышеуказанной общей формулы, являющимися специфическими фотоактивируемыми необратимыми ингибиторами Na,K-аденозинтрифосфатазы.
Соединения I-IV получают способом, основанным на известной реакции циклизации продуктов периодатного окисления рибонуклеотидов с гидразидами кислот в водноорганической среде при pH 4,5-5 [4].
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Дилитиевая соль (1'R,5'R)-3'-аза-3'-(4-азидонафталин-1- -сульфамидо)-1'-(6-аминопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил-6' -дифосфата (I).
К раствору 47 мг (0,1 ммоль) натриевой соли оксо-аденозин-5'-дифосфата, очищенной от примеси йодата натрия, в 5 мл 1М литий-ацетатного буфера (pH 5,0) при перемешивании и красном свете добавляют раствор 34 мг (0,13 ммоль) 4-азидонафталин-1-сульфонилгидразина в 7 мл диоксана. Полученный раствор перемешивают в течение двух часов при комнатной температуре, защищая от света, затем упаривают при пониженном давлении до объема ~ 0,5 мл и обрабатывают 5 мл охлажденной смеси безводный этанол - безводный диэтиловый эфир (3:1, об. ). Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают безводным диоксаном, затем безводным диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме в присутствии фосфорного ангидрида. Получают 39 мг целевого продукта (выход 53%).
Физико-химические свойства полученного соединения представлены в табл. 1.
Пример 2. Трилитиевая соль (1'R, 5'R)-3'-аза-3'-(4-азидонафталин-1-сульфамидо)-1'- (6-аминопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил-6'-трифосфата (II).
В условиях, описанных в примере 1, используя 59 мг (0,1 ммоль) натриевой соли оксо-аденозин-5'-трифосфата, получают 47 мг целевого продукта (выход 56%).
Физико-химические свойства полученного соединения представлены в табл. 1.
Пример 3. Дилитиевая соль (1'R, 5'R)-3'-аза-3'-(5-азидонафталин- 1-сульфамидо)-1'-(6-аминопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил-6' -дифосфата (III).
В условиях, описанных в примере 1, используя 34 мг (0,13 ммоль) 5-азидонафталин-1-сульфонилгидразина, получают 37 мг целевого продукта (выход 49%).
Физико-химические свойства полученного соединения представлены в табл. 1.
Пример 4. Трилитиевая соль (1'R,5'R)-3'-аза-3'-(5-азидонафталин- 1-сульфамидо)-1'-(6-аминопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил-6'- трифосфата (IV).
В условиях, описанных в примере 1, используя 59 мг (0,1 ммоль) натриевой соли оксо-аденозин-5'-трифосфата и 34 мг (0,13 ммоль) 5-азидонафталин-1-сульфонилгидразина, получают 53 мг целевого продукта (выход 63%).
Физико-химические свойства полученного соединения представлены в табл. 1.
Изучение ингибирования Na,K-АТФазы описываемыми соединениями проводили следующим образом.
Препарат Na,K-АТФазы (КФ 3.6.1.37, Na,K-активируемая Mg-зависимая аденозин-5'-трифосфатаза) получают из солевых желез уток, выдержанных на диете с высоким содержанием NaCl. Активность фермента определяют по закислению слабозабуференной среды потенциометрическим способом. Используемый для испытаний препарат Na,K-АТФазы содержит 20 мМ трис-HCl (pH 7,4), 1 мМ ЭГТА, 0,25 мМ сахарозу и белок в концентрации 4 мг/мл и характеризуется удельной активностью 30 мкмоль/мг белка в минуту. Данный препарат лишен активности Mg-активируемой АТФазы. Реакцию начинают внесением препарата Na,K-АТФазы в инкубационную смесь, предварительно термостатированную при 37oC. Среда инкубации имеет следующий состав: 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 3 мМ АТФ, 3 мМ MgCl2, 3 мМ имидазол (pH 7,4). Концентрация белка Na,K-АТФазы составляет 0,5 мкг/мл. При определении концентрации ингибитора, обеспечивающей снижение активности фермента на 50% (I50), в среду инкубации при красном свете вносят изучаемое соединение в различных концентрациях. Реакцию проводят при 37oC в течение 10 минут при красном свете. Количество неорганического фосфата в среде увеличивается пропорционально времени инкубации.
Значение I50 (при красном свете) определяют из графика зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации изучаемого соединения. В указанных условиях значение I50 для соединений I - IV составило 0,82; 0,35; 0,63 и 0,23 мМ, соответственно. Ингибирование носило обратимый характер.
Под действием света (λ = 320±10 нм) происходит необратимое связывание ингибиторов I - IV с ферментом в результате генерации высокореакционноспособного нитренового радикала. Свободнорадикальный механизм реакции делает возможным ковалентное взаимодействие ингибиторов практически с любыми аминокислотными остатками в связывающем участке белка.
Эффект ингибирования Na,K-АТФазы соединениями I - IV в условиях фотолиза увеличивается с течением времени и не уменьшается после их удаления из среды преинкубации (гель-фильтрация), что указывает на необратимое связывание ингибиторов с ферментом. Препарат фермента, модифицированного данными соединениями, после гель-фильтрации обладал выраженными флуоресцентными свойствами (λmaxвозб.= 320 нм, λmaxфлуор.= 394 нм для всех четырех соединений), что также свидетельствует о необратимом связывании ингибиторов I-IV с Na,K-АТФазой.
При совместной преинкубации Na,K-АТФазы с соединениями I-IV и 5 мМ АТФ (субстрат Na, K-АТФазы) наблюдается защитный эффект от действия ингибитора, что указывает на их специфическое взаимодействие с активным центром фермента.
Как указывалось ранее, наиболее близким к описываемым специфическим фотоактивируемым необратимым ингибиторам Na,K-АТФазы является известный 3'-O-[3-(4-азидо-2-нитрофенил)пропионил] аденозин- 5'-трифосфат, не позволяющий проводить изучение Na,K-АТФазы с помощью спектрофлуорометрии.
Как вытекает из приведенных данных, описываемые соединения I-IV, получаемые из доступных исходных продуктов, расширяют арсенал специфических необратимых ингибиторов Na, K-АТФазы для ее более эффективного изучения с помощью спектрофлуорометрии.
Источники информации:
1. Chem. Abstr., 1980, v. 93, 200011 m.
2. C. H. Pedemonte, J.N.Kaplan "Chemical modification as an approach to elucidation of sodium pump structure-function relations" Amer. J. Physiol., 1990, v. 258. p. C1-C23.
3. G.Rempeters, W.Shoner "Evidence for a Mg-induced conformational change at the ATP-binding site of (Na+, K+-ATPase demonstrated with a photoreactive ATP-analogue" Eur. J. Biochem., 1981, v. 121, p. 131-137 - прототип.
4. F. Hannsske, F.Cramer "Untersuchungen zur Struktur perjodatoxydierter Ribonucleoside und Ribonucleotide" Carbohydrate Research, 1977, v. 51, p. 75.
Литиевые соли (1'R,5'R)-3'-аза-3'-(азидонафталин-1-сульфамидо)-1'-(6-аминопуринил-9-)-3'-дезоксигексопиранозил-6'-ди- или трифосфатов общей формулы I, где n = 2 или 3, R1=N3, R2=H или R1=H и R2=N3, могут быть использованы для специфического ингибирования Na, K-аденозинтрифосфатазы. 1 табл.
Литиевые соли (1'R,5'R)-3'-аза-3'-(азидонафталин-1-сульфамидо)-1'-(6-аминопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил-6'-ди-или-трифосфатов общей формулы
где n = 2 или 3;
R1-N3 и R2-H или R1-H и R2-N3 (I-IV)
как специфические фотоактивируемые необратимые ингибиторы Na, К-аденозинтрифосфатазы.
