Способ очистки щелочной фосфатазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/16 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаративной биохимии, и используется для получения очищенной щелочной фосфатазы животного происхождения, которая находит применение в генной инженерии, иммуногистохимических процедурах и иммуноферментном анализе, научно-исследовательской работе.

Цель изобретения - повышение удельной активности щелочной фосфатазы.

Способ заключается в том. что очистку препарата щелочной фосфатазы проводят на ионообменном сорбенте, причем в качестве сорбента используют фосфоцеллюлозу. сорбцию проводят при рН 5.3-6.5, а элюцию - 8-12 мМ Na2HP04. Удельная активность полученной фосфатазы достигает 750-770 ед./мг белка против 70-194 ед./мг по известным способам.

Пример 1. 15 мг препарата щелочной фосфатазы. выделенной из тонкого кишечника тюленя (20 ед./мг белка), растворяют в 10 мл 10 мМ фосфатного буфера рН 5.3, содержащего 1 мМ хлористого магния. Раствор фермента наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (26x280 мги), уравновешенной буфером А, и отмывают тем же буфером до оптической плотности раствора при 280 нм, равной 0,03, Фермент элюируют 10 мМ Na2HPO/5. Ионообменную хроматографию проводят при 4°С. Скорость элюции 30 мл/ч. Фракции, содержащие ферментную активность объединяют и вычисляют удельную активность полученного препарата щелочной фосфатазы, которая равна 750 ед,/мг белка. Выход по активности 80%.

Пример 2,15мг препарата щелочной фосфатазы тюленя (120 ед,/мг белка) растворяют в 10 мл 10 мМ фосфатного буфера рН 5,8, содержащего 1 мМ хлористого магния. Раствор фермента наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (26x280 мм), уравновешенной буфером А, и отмывают ионообмен- никтем же буфером до А280 0,03, Фермент элюируют 10 мМ NaHPG. Ионообменную хроматографию проводят при 4°С. Скорость элюции 30 мл/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и вычисляют активность полученного препарата щелочной фосфатазы. Удельная ;1ктивLO

ю

Ю

иость равна 770 ед./мг белка. Выход по активности 84%.

Пример 3. 15 мг препарата щелочной фосфатазы тюленя (120 ед./мг белка) растворяют в 10 мл 10 мМ фосфатного буфера рН G.5, содержащего 1 мМ хлористого магния, Раствор фермента наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (26x280 мм), уравновешенной буфером А, и отмывают ионообмен- ник тем же буфером до А280 0,03. Фермент элюируют 10 мМ Na2HP04. Ионообменную хроматографию проводят при 4°С. Скорость элюции 30 мл/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и. вычисляют активность полученного препарата щелочной фосфатазы. Удельная активность равна 755 ед,/мг белка, по активности 80%,

Верхняя граница рН обусловлена тем, что при рН выше 6,5 сорбируемость щелочной фосфатазы на фосфоцеллюлозе резко уменьщается, что используется при элюции.

Нижняя граница рН обусловлена тем, что при рН ниже 5,3 наблюдается быстрая денатурация щелочной фосфатазы.

П р и м е р 4. 15 мг препарата щелочной фосфатазы тюленя (НПО Биолар) растворяют в 1-0 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 5,8 содержащего 1 мМ (буфер А). Раствор фермента наносят на колонку с фосфо- ;.;,е/ш1олозой (26x280 мм), уравновешенной буферам 1/1, и отмувэтт тем же буфером до АЗШ, равной 0,03. Фермент элюируют 8 мМ Ма2НР04. Ионообменную хроматографию проводят при 4°С. Скорость элюцми 30 мл/ч. Фракции, содержащие фермеитатив- К УЮ актмзность, объединяют и аычис/тяют 3.:т лвность полученного препарата щелочной фосфзтаэы, которая равна 760 ед./мг балка,

Пример 5. 15 мг препарата щелочной фосфатазы тюленя (НПО Биолар) растворяют в 10 10 мМ фосфатного буфера рН

5

0

0

0

5

0

5

5,8, содержащего 1 мМ MgClj, Раствор фермента наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (26x280 мм), уравновешенной буфером А, и отмывают тем же буфером до А280, равной 0,03. Фермент элюируют 12 мМ NaaHPO/j, Ионообменную хроматографию проводят при . Скорость элюции 30 мл/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и вычисляют активность полученного препарата щелочкой фосфатазы, которая равна 745 ед./мг белка.

При использовании растворов NaaHPO i концентрацией ниже 8 мМ резко ухудшается элюция щелочной фосфатазы с сорбента. Растворы iNJa2HPO i концентрацией выше 12 мМ элюируют не только щелочную фосфатз- зу, но и ряд балластных белков, что приводит к понижению удельной активности целевого продукта.

При использовании вместо фосфата натрия растворов NaCt вплоть до концентрации 0,5 М не наблюдается какой-либо десорбции фермента.

Изобретение поэволяет создать простой и легко масштабируемый процесс выделения и очистки щелочной фосфатазы при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырья.

Формула изобретения Способ очистки щелочной фосфатззы, зключающий адсорбцию препарата щелочной фосфатазы на ионообг-ченном сорбенте и злюцию целевого продукта водным буферным раствором, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта, в качестве ионообменного сорбента используют фос- фоцеллюлозу, адсорбцию проводят при рН 5,3-6,5, а элюцию осуществляют 8-12 мМ раствором натрия фосфорнокислого одно- замещенного.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаративной биохимии. Цель изобретения - повышение удельной активности щелочной фосфатазы. Способ заключается вхроматографической очистке, причем в качестве сорбента используют фосфоцеллюлозу, сорбцию проводят при рН 5,3-6,5, а элюцмю - 8-12 мМ Na2HP04. Выход продукта по активности 80-84%, а удельная активность 750-770 ед./мг белка.