СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОТСРОЧЕННОЙ АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и может быть использовано для выявления больных, предраспосположенных к так называемым отсроченным реакциям на аллергены.

При анализе патентной и научно-медицинской литературы не обнаружено сведений о способах прогнозирования отсроченных аллергических реакций.

Целью изобретения является создание способа прогнозирования отсроченных аллергических реакций, обеспечивающего возможность выявления in vitro специфичных к интерлейкину-3 (ИЛ-3) иммуноглобулинов Е (IqЕ-антител) в крови больных, дающих отсроченные аллергические реакции.

Цель достигается тем, что исследуемую in vitro гепаринизированную кровь больного делят на две равные части. При этом в контрольную пробу вносят растворитель, не повреждающий базофилы, а в опытную пробу вносят раствор интерлейкина-3 (ИЛ-3) в конечной концентрации 300 нг/мл, инкубируют обе пробы в термостате, затем обрабатывают их красителем, избирательно окрашивающим базофилы, и определяют содержание базофилов в каждой пробе. При снижении их количества в опытной пробе на 10% и более по сравнению с контрольной прогнозируют отсроченную аллергическую реакцию.

Выбор оптимальной концентрации ИЛ-3, добавляемого к опытной пробе крови при использовании заявляемого способа, проводили путем исследования влияния различных концентраций ИЛ-3 на точность прогноза. Были исследованы три группы детей:
I группа - больные аллергическими заболеваниями с подтвержденными отсроченными реакциями на аллерген (34 человека).

II группа - больные аллергическими заболеваниями с отсутствием отсроченных реакций на аллерген (71 человек).

III группа - здоровые дети без аллергических заболеваний (28 человек).

Наличие или отсутствие отсроченных аллергических реакций подтверждали на основе результатов контрольного диагностического обследования с использованием ингаляционно-провокационного теста по известной методике [1] . Результаты представлены в табл. 1.

Из данных табл. 1 видно, что именно концентрация ИЛ-3, равная 300 нг/мл, обеспечила наибольшую точность прогноза в группе больных с подтвержденными отсроченными аллергическими реакциями (I группа) при отсутствии ложноположительных результатов в контрольных группах (II и III группа).

Для выявления интервала прогностически значимых различий количества базофилов в опытной и контрольной пробах, обеспечивающих наибольшую точность прогнозирования, с использованием заявленного способа были обследованы три группы лиц:
I - больные аллергическими заболеваниями с подтвержденными отсроченными реакциями на аллерген (34 человека);
II - больные аллергическими заболеваниями с отсутствием отсроченных реакций на аллерген (71 человек);
III - здоровые дети без аллергических заболеваний (28 человек).

Наличие или отсутствие отсроченных аллергических реакций подтверждали на основании результатов контрольного диагностического обследования с использованием ингаляционно-провокационного теста по методике [1] . Результаты представлены в табл. 2.

Из данных табл. 2 следует, что прогностически значимым является различие количества базофилов в опытной и контрольной пробах, равное 10% и более, т. к. при этих значениях достигается максимальное количество подтвержденных контролем положительных результатов при отсутствии ложноположительных результатов в контрольных группах.

Для доказательства специфичности заявленного способа были обследованы три группы лиц:
I группа - больные аллергическими заболеваниями с подтвержденными отсроченными аллергическими реакциями (34 человека);
II группа - больные аллергическими заболеваниями с отсутствием отcроченных аллергических реакций (71 человек);
III группа - дети без аллергических заболеваний (28 человек).

В исследуемых группах выявляли истинные, ложноположительные и ложноотрицательные из числа прогнозируемых отсроченных аллергических реакций. При этом под истинной реакцией понимали прогнозируемую при использовании заявленного способа отсроченную аллергическую реакцию, подтвержденную результатом контрольного диагностического обследования с использованием ингаляционно-провокационного теста [1] .

Под ложноположительной понимали прогнозируемую заявленным способом отсроченную аллергическую реакцию, не подтвержденную результатом ингаляционно-провокационного теста. Под ложноотрицательной понимали реакцию, установленную при использовании ингаляционно-провокационного теста, но не подтвержденную результатом заявленного способа. Результаты представлены в табл. 3.

Из приведенных данных табл. 3 видно, что заявляемый способ является специфичным, т. к. не дает ни ложноположительных, ни ложноотрицательных результатов как в группе больных с подтвержденными отсроченными аллергическими реакциями, так и в контрольных группах.

Возможность достижения указанного технического результата при осуществлении изобретения обусловлена следующим. Известно, что при воздействии аллергена на клетки-мишени аллергических реакций, в частности на базофилы, содержащие на своей поверхности IqE, из них выделяются медиаторы анафилаксии, вызывающие немедленные аллергические реакции, и хемотаксические факторы, привлекающие в место реакции различные клетки, в том числе лимфоциты, которые выделяют вещества, способные вызывать отсроченные аллергические реакции, т. к. для их выделения необходимо 5-8 ч [1] . Известно также, что отсроченные реакции развиваются только у части (47-73% ) больных с немедленными реакциями на аллерген [2] .

В настоящее время патогенез отсроченных аллергических реакций неясен, их объясняют воспалительными реакциями, развивающимися в стенке бронхов при воздействии простагландинов, лейкотриенов, интерлейкинов [1,2,4] . Описаны многочисленные физиологические эффекты этих факторов [3,5] , но при анализе патентной и научно-медицинской литературы не обнаружено работ по исследованию влияния ИЛ-3 на дегрануляцию базофилов крови и связи этого явления с отсроченными реакциями при аллергии.

По мнению авторов заявленного решения, у некоторых больных аллергическими заболеваниями имеются сенсибилизация к ИЛ-3, т. е. присутствуют специфичные к ИЛ-3 IqE-антитела в крови, которые обладают способностью избирательно присоединяться к клеткам-мишеням аллергических реакций, в частности к базофилам. Именно у таких больных развиваются отсроченные реакции вследствие взаимодействия высвобождающегося из скапливающихся в месте немедленной реакции клеток интерлейкина-3 с IqE на поверхности базофилов, что приводит к их дегрануляции и высвобождению вследствие этого гистамина и других медиаторов анафилаксии, вызывающих клинику отсроченной аллергической реакции.

Экспериментальными исследованиями авторов заявленного способа установлено, что сенсибилизация базофилов здоровых лиц сывороткой крови больных с отсроченными реакциями вызывает дегрануляцию базофилов здоровых лиц в ответ на ИЛ-3. Установлено также, что инактивация сыворотки больных отсроченными реакциями при температуре 56^оС в течение 4 ч (режим инактивации IqE) приводит к исчезновению сенсибилизирующих свойств сыворотки.

Таким образом, выявленная авторами заявленного решения взаимосвязь между явлением дегрануляции базофилов в ответ на ИЛ-3 и отсроченными реакциями на аллергены у больных с аллергическими заболеваниями позволяет выявить in vitro специфичные к ИЛ-3 IqE-антитела, присутствующие только у больных с отсроченными аллергическими реакциями.

Способ осуществляют следующим образом. У больного утром натощак берут 0,2 мл крови из пальца в пробирку, содержащую 0,01 мл гепарина в концентрации 200 ед/мл (конечная концентрация гепарина в крови 10 ед/мл). Пробирку встряхивают для смешивания крови с гепарином и отбирают 0,06 мл крови в контрольную пробирку и 0,06 в опытную. В контрольную пробирку добавляют растворитель, не повреждающий базофилы, например 0,02 мл забуференного физраствора, в опытную - 0,02 мл раствора ИЛ-3 в концентрации 900 нг/мл (конечная концентрация ИЛ-3 равна 300 нг/мл). Обе пробирки помещают в термостат при 37^оС на 15 мин. По окончании срока инкубации пробирки вынимают из термостата и добавляют в обе пробирки краситель, избирательно окрашивающий базофилы, например по 0,54 мл раствора толуидинового синего (для приготовления краски 0,025 г сухой краски толуидиновый синий смешивают с 100 мл 30% этилового спирта и доводят рН краски до 3,4-3,6 с помощью ледяной уксусной кислоты). При использовании указанного красителя целые базофилы окрашиваются в красный цвет, а дегранулировавшие базофилы не окрашиваются. С помощью камеры подсчитывают под микроскопом число базофилов в 1 мм³ в контрольной и опытной пробах и определяют, на сколько процентов количество базофилов в опытной пробе меньше, чем в контрольной по формуле:
100% , где Б_контр. - количество базофилов в 1 мм³ в контрольной пробе;
Б_опыт. - количество базофилов в 1 мм³ в опытной пробе. При снижении числа базофилов в опытной пробе по сравнению с контрольной на 10% и более прогнозируют отсроченные реакции у больных с аллергией.

П р и м е р 1. Больная Аня К. , 13 лет, история болезни N 5140, поступила для обследования в аллергологическое отделение ДГБ N 1 Ленинграда с диагнозом: бронхиальная астма, атопическая, гормонозависимая, тяжелое течение, внеприступный период. Из анамнеза болезни известно, что впервые приступ затрудненного дыхания возник в возрасте 1 г. 10 мес. на фоне нормальной температуры, приступ был купирован в больнице преднизолоном. Затем частые приступы удушья, требующие реанимационных мероприятий и использования кортикостероидов. Провоцируют приступы физическая нагрузка, охлаждение. Приступы также возникают "беспричинно" ночью в домашних условиях. С целью прогнозирования отсроченных аллергических реакций больная обследована с использованием заявленного способа. На второй день после поступления в стационар у больной утром натощак взяли из пальца 0,2 мл крови в пробирку с гепарином (конечная концентрация гепарина 10 ед/мл). Пробирку встряхнули для смешивания крови с гепарином и отобрали 0,06 мл крови в контрольную пробирку и 0,06 мл в опытную. В контрольную пробирку добавили 0,02 мл забуференного физраствора, а в опытную 0,02 мл раствора ИЛ-3 в концентрации 900 нг/мл (конечная концентрация ИЛ-3 в растворе 300 нг/мл).

Обе пробирки поместили в термостат при 37^оС на 15 мин. По окончании срока инкубации пробирки вынули из термостата и добавили в обе пробирки 0,54 мл 0,025% краски толуидиновый синий, приготовленной на 30% этиловом спирте, рН краски 3,4. С помощью камеры подсчитали число базофилов в контрольной и опытной пробах, которое составило соответственно 50 и 45 базофилов в 1 мм³. По формуле определили на сколько процентов количество базофилов в опытной пробирке меньше, чем в контрольной:
100 % = 10 % . Поскольку число базофилов в опытной пробе снизилось на 10% по сравнению с контрольной, у больной спрогнозирована отсроченная аллергическая реакция, которая была подтверждена на 4 день пребывания больной в стационаре при проведении ингаляционного провокационного теста с аллергеном домашней пыли (серия 246). С помощью пневмотахометра у больной определяли максимальную скорость выдоха до, сразу после и через 5 мин после ингаляции физраствора, которые различались между собой менее чем на 5% , т. е. гиперреактивность на физраствор отсутствовала. Затем больной проводили ингаляции аллергена домашней пыли (серия 246) в разведении 10⁶. Измеряли пиковую скорость выдоха сразу после, через 5 мин и через 20 мин после ингаляции домашней пыли. Через 20 мин после ингаляции пиковая скорость выдоха снизилась на 25% по сравнению с пиковой скоростью выдоха после ингаляции физраствора, т. е. получена немедленная аллергическая реакция на домашнюю пыль. Затем пиковую скорость выдоха измеряли каждый час. К концу 2 ч пиковая скорость выдоха восстановилась и не отличалась от таковой после ингаляции физраствора, но через 6 ч после ингаляции аллергена пиковая скорость выдоха снизилась на 35% по сравнению с пиковой скоростью выдоха после ингаляции физраствора, т. е. развилась отсроченная аллергическая реакция. Это сопровождалось также развитием приступа бронхиальной астмы у данной больной, который удалось купировать только после внутривенного введения преднизолона, т. к. ни адреномиметики, ни эуфиллин не снимали бронхоспазма. Таким образом, предсказанная с помощью заявленного способа отсроченная аллергическая реакция подтвердилась при проведении ингаляционно-провокационного теста.

П р и м е р 2. Больной Саша К. , история болезни N 7430, поступил на аллергологическое отделение с диагнозом: бронхиальная астма, атопическая, паторецепторная, среднетяжелая, внеприступный период. Из анамнеза болезни известно, что приступы удушья беспокоят с 3 лет (в момент госпитализации больному 9 лет), возникают при проведении уборки дома, при пребывании в пыльных помещениях, при физической нагрузке и при воздействии резких запахов, купируются введением эуфиллина или ингаляциями адреномиметиков. На второй день после поступления в стационар больной обследован с помощью заявленного способа. Количество базофилов в контрольной пробе составило 48 клеток в 1 мм³, а в опытной (добавлен ИЛ-3) - 35 клеток в 1 мм³, т. е. количество базофилов в опытной пробе снизилось по сравнению с контрольной на 27% , т. е. у больного спрогнозирована отсроченная аллергическая реакция, которая подтвердилась при проведении ингаляционной провокационной пробы с аллергеном домашней пыли серии 66 - падение пиковой скорости выдоха через 7 ч после ингаляции домашней пыли на 25% по сравнению с пиковой скоростью выдоха после ингаляции физраствора, что сопровождалось также развитием нетяжелого приступа бронхоспазма, купировавшегося после ингаляции беротека. Таким образом, ингаляционно-провокационная проба подтвердила спрогнозированную с помощью заявленного способа отсроченную аллергическую реакцию.

П р и м е р 3. Больная Юля С. , 4 года, история болезни N 6608, поступила на аллергологическое отделение с диагнозом: астматический бронхит, средней тяжести, внеприступный период. Приступы затрудненного дыхания с 1 года, провоцируются запахом и приемом рыбы, резкими запахами. При проведении кожных скарификационных проб причинно-значимый аллерген не выявлен, т. к. пробы с пищевыми, пылевыми, пыльцевыми, эпидермальными аллергенами были отрицательными. С помощью заявленного способа у больной спрогнозированы отсроченные аллергические реакции, т. к. в опытной пробе с ИЛ-3 количество базофилов было на 16% меньше, чем в контрольной с физраствором. Проведение ингаляционно-провокационных проб было невозможным, т. к. из-за малого возраста больная была неспособна выполнять указания врача. Во время пребывания в отделении больная по недосмотру съела кусок рыбы.

Сразу после употребления рыбы каких-либо изменений в состоянии больной не отмечено, но через 6,5 ч после употребления рыбы больная дала тяжелую аллергическую реакцию в виде бронхоспазма, отека век, губ, падения артериального давления, которую удалось купировать только после повторного введения адреналина, кортикостероидов, внутривенного введения больших количеств жидкости с целью восполнения объема циркулирующей крови. Таким образом, спрогнозированная при использовании заявленного способа отсроченная аллергическая реакция подтверждена клинически (развитие симптомов аллергического заболевания через 6,5 ч после контакта с аллергеном).

С использованием заявленного способа было обследовано 198 детей с аллергическими заболеваниями, из них 139 детей с бронхиальной астмой, 39 детей с аллергическим бронхитом, 20 детей с аллергическим трахеобронхитом. Все дети на второй день после поступления в аллергологическое отделение были обследованы с помощью заявленного способа. Для подтверждения прогноза, полученного при использовании заявленного способа, 154 ребенка старше 5 лет были обследованы с использованием диагностического ингаляционно-провокационного теста [1] , принятого в качестве контроля, у 44 детей младше 5 лет проведение контрольного диагностического обследования не представлялось возможным, т. к. его методика предполагает сознательное выполнение больным требований врача. Кроме того, производили хронометрирование прогностической процедуры при использовании заявленного способа, а также диагностической процедуры контрольного обследования. Результаты представлены в табл. 4.

Из данных табл. 4 видно, что прогнозируемые с помощью заявленного способа отсроченные аллергические реакции в 96% случаев подтверждались при проведении диагностического ингаляционно-провокационного теста.

Отсутствие подтверждения прогноза у двух больных по мнению авторов заявленного решения может быть обусловлено тем, что лекарства, принимаемые больными, а именно преднизолон и задитен, отмененные за 2 дня до проведения ингаляционно-провокационной пробы с аллергеном, в силу их пролонгированного действия могут влиять на результаты ингаляционного провокационного теста (вызывать ложно-отрицательные результаты), подавляя отсроченную реакцию на аллерген. Из табл. 4 видно также, что заявленный способ характеризуется относительно небольшим временем, затрачиваемым на проведение анализа, при полном отсутствии каких-либо побочных отрицательных эффектов ( частности, отсутствовало развитие бронхоспазма, которое наблюдалось клинически в виде приступа удушья у 33% больных при проведении ингаляционно-провокационного теста).

Таким образом, заявляемый способ, позволяющий in vitro выявлять специфичный к интерлейкину-3 иммуноглобулин Е в крови больных, дающих отсроченные аллергические реакции, обеспечивает безопасность больного, т. к. исключен контакт больного с веществами, способными вызвать обострение аллергического заболевания, и возможность применения для лиц различного возраста (включая детей младше 5 лет), а также у лиц с обострением аллергического заболевания. (56) 1. Либерман Ф. и Кроуфорд Л. Лечение больных аллергией. Пер. с англ. , М. : Медицина, 1986, с. 26-27, 73-77.

2. A. Tenabene, J. C. Kepferschmidt-Kubler, J. C. Bessof, J. Pauli. La reaction bronchique retardee eu non immediate. Rev. Fr. Allergol. , 1990, 30, N 2, 103-110.

3. F. R. Balkwill, F. Burke. The cytokine network. Immunol. today, 1989, 10, N 9, 299-304.

4. Holgate S. T. , Finnerty J. P. Recent advances in understanding the pathogenesis of asthma and its clincal implications. Quart J. Med. , 1988, 66, N 249, 5-19.

5. Henderson W. R. Lipid-derived and other chemical mediators of inflammation in the lung. J. Allergy Clin. Immunology, 1987, 79, 543-553.

6. Ji. Pepys, H. Hutcheroft. Bronchial provocation tests in asthma. Am. Rev. Respir. Dis. , 1975, 112, 841-859.

Использование: область медицины, а именно аллергология. Цель - ранняя диагностика отсроченной аллергической реакции. Сущность изобретения: исследуемую in vitro гепаринизированную кровь больного делят на две части, в контрольную пробу крови вносят растворитель, в опытную пробу вносят раствор интерлейкина-3 в конечной концентрации 300 нг/мл. Инкубируют обе пробы в термостате, затем обрабатывают их красителем и определяют содержание базофилов в каждой пробе. При снижении уровня базофилов в опытной пробе на 10% и более по сравнению с контролем прогнозируют отсроченную аллергическую реакцию. Способ обеспечивает возможность выявления in vitro специфичного к интерлейкину-3 иммуноглобулина Е в крови больных, дающих отсроченные аллергические реакции. 4 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОТСРОЧЕННОЙ АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ путем иммунологического исследования организма больного, отличающийся тем, что исследуют гепаринизированную кровь больного, при этом в одну из проб добавляют раствор интерлейкина -3 в конечной концентрации 300 нг/мл, а в другую растворитель, далее обе пробы инкубируют в термостате, обрабатывают красителем и определяют содержание базофилов в каждой пробе и при снижении их количества в пробе, содержащей интерлейкин-3, на 10% и более по сравнению с другой пробой диагностируют отсроченную аллергическую реакцию.