СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХЛОРОФИЛЛА, МЕЧЕННОГО РАДИОАКТИВНЫМ ИЗОТОПОМ C Российский патент 1995 года по МПК C07B59/00 A01H4/00 

Изобретение относится к технологии получения радиоактивных органических соединений, в частности к способам введения радиоактивной метки в природные соединения, и может быть использовано в научно-исследовательских лабораториях для изучения метаболизма и биологической активности хлорофилла и продуктов его биотрансформации.

Известен способ введения радиоактивного изотопа в природные органические соединения жирные кислоты [1] предусматривающий обработку жирных кислот иодидом натрия. По аналогии с этим способом может быть получен и меченый хлорофилл. Экспериментально установлено, что при использовании данного способа хлорофилл подвергается достаточно жесткому воздействию иодида, в результате чего происходит образование побочных продуктов и почти полное превращение хлорофилла в феофитин.

Известен также способ получения радиоактивных нуклеотидов [2] предусматривающий инкубирование (5,6 ³Н) цитидинтрифосфата с клетками E.coli. По аналогии с этим способом меченый хлорофилл не может быть получен в результате его биосинтеза в присутствии радиоактивных предшественников, так как в клетках E.coli отсутствует хлорофилл.

Известен также способ введения радиоактивной метки в хлорофилл биосинтетическим путем в результате выращивания зеленых растений в присутствии С¹⁴О₂ [3]
По своей сущности способ является наиболее близким к предлагаемому изобретению и выбран в качестве прототипа.

Однако указанный способ не обеспечивает необходимой эффективности включения С¹⁴ в структуру хлорофилла. Это обусловлено тем, что в процессе выращивания растений происходит преимущественное включение С¹⁴ в продукты фотосинтеза крахмал, сахарозу, органические кислоты и др. а не в структуру хлорофиллов. Это приводит к уменьшению удельной радиоактивности хлорофилла, которая может лишь достигать величины 0,1-0,4 Ки/моль. Такое низкое качество меченого препарата затрудняет его использование на практике.

Предлагаемый способ предназначен для получения хлорофилла, меченного радиоактивным изотопом С¹⁴ с удельной активностью 5-10 Ки/моль.

Осуществление изобретения позволяет реализовать новый технический результат, которым является достижение величины удельной радиоактивности 5-10 Ки/моль.

Сущность изобретения выражается в совокупности следующих существенных признаков.

Способ получения хлорофилла, меченного радиоактивным изотопом С¹⁴, предусматривает его выделение из выращиваемого растительного объекта в присутствии радиоактивного элемента, при этом в качестве растительного объекта используют зеленные культуры, при этом выращивание осуществляют на питательной среде, содержащей следующие компоненты, мг/дм³ дистиллированной воды:
Глицин, меченный в
положении 1 0,05.0,1
Глицин, меченный в
положении 2 0,05.0,1
Магния хлорид 10.25
Натрия хлорид 0,5.1,5
Калия хлорид 3.9
Меланин 10.20
Кислый фосфат калия 30.40 с последующим выделением и очисткой хлорофилла известными способами. Кроме того, в качестве зеленных культур используют шпинат или щавель, или амарант, или салат, или петрушку, или укроп.

Отличительными признаками являются:
использование в качестве растительных объектов зеленных культур (щавеля или шпината, или амаранта, или салата, или петрушки, или укропа);
выращивание растительных объектов на среде, содержащей следующие компоненты, мг/дм³ воды:
Глицин, меченный
в положении 1 0,05.0,1
Глицин, меченный
в положении 2 0,05.0,1
Магния хлорид 10.25
Натрия хлорид 0,5.1,5
Калия хлорид 3.9
Меланин 10.20
Кислый фосфат калия 30.40
Неизвестно использование культуры щавеля или шпината, или амаранта, или салата, или петрушки, или укропа для получения радиоактивного хлорофилла. Неизвестно также выращивание указанных растений на среде, содержащей компоненты, мг/дм³ воды:
Глицин, меченный
в положении 1 0,05.0,1
Глицин, меченный
в положении 2 0,05.0,1
Магния хлорид 10.25
Натрия хлорид 0,5.1,5
Калия хлорид 3.9
Меланин 10.20
Кислый фосфат калия 30.40
Достижение технического результата в данном изобретении осуществляется за счет того, что в качестве растительных объектов используют культуры листовых овощных растений, которые выращивают на среде, содержащей следующие компоненты, мг/дм³ воды:
Глицин, меченный
в положении 1 0,05.0,1
Глицин, меченный
в положении 2 0,05.0,1
Хлорид магния 10.25
Хлорид натрия 0,5.1,5
Хлорид калия 3.9
Меланин 10.20
Кислый фосфат калия 30.40
На чертеже приведена кривая изменения активности хлорофилла в зависимости от кратности циклов очистки.

Способ осуществляется следующим образом.

Семена зеленных культур высаживают на искусственную почву (песок), которую смачивают питательной средой, содержащей вышеперечисленные компоненты. Семена проращивают в условиях искусственной инсоляции (300 Вт/м²) в течение 30-42 дней. Зеленную биомассу (листья) затем снимают, измельчают и заливают смесью этилового спирта с ацетоном при соотношении объемов 1:3 и массы листьев и экстрагента 1:10. Экстракцию биомассы проводят в течение 15.24 ч при температуре 0^оС. После этого экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе и затем сухой остаток снова растворяют в спирте. Процедуру повторяют 5-15 раз. Перед каждым упариванием отбирают аликвоту экстракта и определяют величину радиоактивности. По полученным данным строят зависимость изменения радиоактивности экстракта от количества циклов растворение-упаривание. При достижении стационарного уровня радиоактивности экстракт упаривают досуха, после чего его растворяют в 100-1000 мкл спирта и наносят на стартовую позицию тонкослойной хроматографической пластины. Пластину хроматографируют в системе растворителей гептан метилэтилкетон (5:3). Выделяют зону хлорофилла, который затем элюируют с пластины спиртом, и получают раствор готового препарата. Готовый препарат подвергают физико-химическому анализу, в результате которого определяют подлинность препарата, его радиохимическую чистоту и удельную радиоактивность.

П р и м е р 1. Получали меченый хлорофилл по С¹⁴ для проведения фармакокинетических исследований. Для этого посадили 200 семян шпината на предварительно промытый песок, который смочили питательной средой, содержащей следующие компоненты, мг/дм³ в воде:
Глицин, меченный в положении 1 0,05
Глицин, меченный в положении 2 0,05
Магния хлорид 10
Натрия хлорид 0,5
Калия хлорид 3
Меланин 10
Кислый фосфат калия 30
Через 30 дней зеленную массу сняли. Отобрали 100 г зеленной массы, которую измельчили ножницами и залили 1000 г экстрагента (спирт-ацетон 1:3) и поставили на 15 ч в холодильник. После этого экстракт отделили от листьев, отобрали аликвоту 0,1 мл, которую перенесли в сцинцилляционную кювету и измерили ее радиоактивность, которая составила 10 кБк. Затем раствор упарили досуха и снова растворили в 1000 г спирта. Процедуру повторили 8 раз. Перед каждым упариванием отбирали 0,1 мл раствора и измеряли его радиоактивность. По полученным данным строили график (чертеж), из которого определили, что для выхода на стационарный уровень достаточно провести 8 циклов растворение упаривание. После завершения 8 циклов растворения упаривания сухой остаток растворили в 0,5 мл спирта. Полученный раствор нанесли на тонкослойную пластину "Силуфол", которую хроматографировали в системе растворителей гептан метилэтилкетон (5:3). Зону хлорофилла элюировали с пластины спиртом. В результате получили 1 мл готового раствора хлорофилла, меченного С¹⁴.

Радиохимическая чистота препарата составила 95%
Удельная радиоактивность препарата составила 5,6 Ки/моль.

Параллельно проводили получение С¹⁴-хлорофилла по прототипу. Данные приведены в таблице.

П р и м е р ы 2-9 поясняют осуществление способа аналогично примеру 1 на различных зеленных культурах при различных концентрациях питательного раствора.

Результаты исследований приведены в таблице.

П р и м е р 10 поясняет получение хлорофилла, меченного радиоактивным изотопом С¹⁴, по прототипу. Результаты приведены в таблице.

Как видно из таблицы, предлагаемый способ позволяет достичь нового технического результата, заключающегося в повышении по сравнению с прототипом удельной радиоактивности в 7-29 раз.

Использование: биохимия, селекционно-генетические исследования. Сущность изобретения: хлорофилл, меченный радиоактивным изотопом C¹⁴, получают путем выращивания зеленых культур на искусственной питательной среде, содержащей радиоактивные элементы, с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 1 з.п.ф-лы, 1 ил. 1 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХЛОРОФИЛЛА, МЕЧЕННОГО РАДИОАКТИВНЫМ ИЗОТОПОМ C¹⁴, включающий выращивание растительного объекта в присутствии радиоактивного элемента, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве растительного объекта используют зеленые культуры и выращивание осуществляют на питательной среде следующего состава, мг/л:
Глицин, меченный в положении 1 0,05 0,1
Глицин, меченный в положении 2 0,05 0,1
Магния хлорид 10,0 25,0
Натрия хлорид 0,5 1,5
Калия хлорид 3,0 9,0
Меланин 10,0 20,0
Кислый фосфат калия 30,0 40,0
Вода дистиллированная До 1 л
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве зеленных культур используют шпинат, щавель, амарант, салат, петрушку или укроп.