СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЛИХОРАДКИ КУ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/118 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам изготовления вакцины для профилактики лихорадки Ку.

Известен способ получения живой вакцины для профилактики лихорадки Ку, включающий накопление коксиелл Бернета II фазы при культивировании в куриных эмбрионах в течение 7 дней, приготовление суспензии на физиологическом растворе, центрифугирование с последующим забором и розливом надосадочной жидкости [1]
Однако вакцина, полученная известным способом, обладает потенциальной возможностью спонтанной реверсии к фазе I и последующих вызываемых ею патологических изменений [2-5]
Наиболее близким аналогом является способ получения вакцины против лихорадки Ку, включающий накопление коксиелл Бернета штамма Henzerling I фазы при культивировании в куриных эмбрионах в течение 7 дней, выделение и инактивацию полученной биомассы, ее очистку от тканей хозяина, приготовление суспензии в дистиллированной воде с последующей обработкой ее 6%-ной трихлоруксусной кислотой, центрифугированием, диализом надосадочной жидкости и отделением растворимого антигена (целевой продукт) из надосадка [6]
Однако вакцина, полученная по данному способу, обладает низкой иммуногенной активностью, требующей многократного применения.

Технический результат изобретения заключается в получении высокоиммуногенной вакцины.

Технический результат достигается использованием:
для накопления коксиелл белых мышей,
для очистки антигенов коксиелл от ткани хозяина систем несовместимых полимеров,
для получения растворимого компонента вакцины ультразвука,
объединением коксиелл I фазы с растворимым антигеном.

Пример 1. 200 белых мышей массой 12,0±1,0 г заражают внутрибрюшинно 0,5 мл 6%-ной суспензией инфицированных коксиеллами Бернета штамм "Луга-1" I фазы желточных мешков куриного эмбриона и на 6 день после их заражения убивают хлороформом, извлекают селезенки, объединяют и добавляют 0,9%-ный раствор хлорида натрия из расчета 15 мл/г селезеночного материала. Затем селезенки растирают в гомогенизаторе при скорости вращения 8000 об/мин в течение 10-15 мин, добавляют формалин до конечной концентрации 1% и суспензию инактивируют при 4^oC в течение 14 дней.

Инактивированную суспензию центрифугируют, отделяют осадок и проводят очистку коксиелл Бернета от тканей хозяина путем последовательной обработки сначала 0,75% -ным раствором трипсина, подогретого до 37^oC, в течение 20-30 мин, затем 6%-ным раствором полиэтиленгликоля (ПЭТ) мол.м. 6000 или мол.м. 4000.

Перемешивают до полного растворения и добавляют натрий сульфат декстрана 500 в количестве 0,3% на объем. Снова тщательно перемешивают до растворения всех компонентов. Выдерживают 30 мин при 4^oC. Далее после центрифугирования супернатант обрабатывают 10%-ным раствором хлороформа. После многократного центрифугирования получают очищенную биомассу коксиелл. Полученную очищенную биомассу коксиелл делят на две части.

Одну часть полученных высокоочищенных коксиелл Бернета используют при приготовлении вакцины как корпускулярный антиген (компонент 1). Другую часть используют для получения растворимого антигена (компонент 2). Для этого осадок коксиелл суспендируют в дистиллированной воде и многократно подвергают ультразвуковой обработке на диспергаторе УЗДН-А с частотой генератора и излучателя 22,0+1,65 кГц по 15 мин с 1-3 перерывами по 1 мин, центрифугируют при 1000 об/мин, отбирают надосадочную жидкость, затем центрифугируют при 18000 об/мин, отбирают, вновь обрабатывают и объединяют надосадочную жидкость. Полученный растворимый антиген доводят до титра 1:10 по РСК (реакция связывания комплемента), который и является вторым компонентом для приготовления вакцины.

Для получения одной прививочной дозы используют 16 мкг корпускул коксиелл Бернета 1 фазы и 065 мл растворимого антигена с титром 1:10 по РСК.

Пример 2. Полученную вакцину по примеру 1, содержащую 16 микрограмм корпускул коксиелл Бернета 1 фазы и 0,5 мл растворимого антигена с титром 1:10 по РСК, вводят морским свинкам массой 300 г подкожно. После введения вакцины морских свинок термомметрируют 14 дней. У некоторых животных отмечено повышение температуры на следующий день после введения вакцины до 39,8-40^oC при норме 39,5^oC. Во всех случаях не отмечены острая и хроническая токсичности. Клиническая картина крови у всех свинок была нормальной. Не отмечено влияние на центральную нервную систему и детоксицирующую функцию печени. Исследование сыворотки крови, взятой на 30 день после вакцинации, выявило специфические антитела у всех животных в титре от 1:40 до 1:320, которые сохранялись в высоком уровне в течение 2 месяцев (срок наблюдения). Спустя месяц вакцинорованным свинкам вводят 10,000 ИД вирулентных коксиелл Бернета штамма Henzerling. Все животные оказались иммунными, в то время как у контрольных невакцинированных животных наблюдалась лихорадка с температурой до 41^oC, которая длилась в течение 4-7 дней.

Представленные данные показывают, что вакцина против лихорадки Ку обладает высокой иммуногенной активностью, длительностью сохранения иммунитета при однократной вакцинации, к тому же она безопасна.

Источники информации.

1. Гениг В. А. Вопросы инфекционной патологии и иммунологии. 1963, 3, 165.

2. Baca O.G. Paretsky D. Q fever and C. burnetii, Microb. Revus. 1983, 47, 127-149.

3. Brezina R. Urvolgyi Y. The study of C.burnetii antigenic structure. Acta virol. 1962, 6, 43-88.

4. Brezina R. Schramec S. Kazar J. Urvolgyi Y. q fever chemovaccine for human use. Acta virol. 1974, 18, 269.

5. Cracea E. Dumitrescu S. Botez D. et al. Local pathogenic effects of Q fever vaccines. Arch. Roum. Pathol. Exp. Microb. 1972, 313, 367-372.

5. Cracea E. Dumitrescu S. Botez D. et al. Immunization in man with a soluble Q fever vaccine. Arch. Roum. Pathol. Exp. Microb. 1973, 32, 1, 45-51.

Использование: биотехнология, вакцина для профилактики лихорадки Ку, антиген. Сущность изобретения: для получения высокоиммуногенной вакцины накопление риккетсий (коксиелл) Бернета проводят в селезенках белых мышей. Выделение их и очистку от тканей хозяина проводят в системе несовместимых полимеров. Используют часть полученного очищенного корпускулярного антигена в качестве первого компонента вакцины. Другую часть корпускулярного антигена подвергают ультразвуковой обработке и центрифугированию и получают растворимый антиген, как второй компонент вакцины. Компоненты 1 и 2 объединяют в соотношении: 16 мкг корпускул коксиелл и 0,5 мл растворимого антигена с титром 1:10 по РСК. Полученная вакцина обладает высокой иммуногенной активностью, длительностью сохранения иммунитета при однократной вакцинации, к тому же она безопасна.

Способ получения вакцины против лихорадки Ку, включающий накопление коксиелл Бернета, выделение и инактивацию полученной биомассы, ее очистку от тканей хозяина, суспендирование в дистиллированной воде, обработку полученной суспензии с последующим центрифугированием и отделением растворимого антигена из надосадочной жидкости, отличающийся тем, что накопление коксиелл проводят в селезенках белых мышей, очистку от тканей хозяина проводят путем последовательной обработки 0,3 1%-ным раствором трипсина, 4 10%-ным раствором полиэтиленгликоля с мол. м. 4000 или 6000 в присутствии 0,1 0,4% на объем суспензии натрия сульфат декстрана 500 и затем 5 15% хлороформа, очищенную биомассу коксиелл делят на две части, одну из которых используют как корпускулярный антиген, а другую после суспендирования обрабатывают ультразвуком и отделяют растворимый антиген, далее корпускулярный и растворимый антигены объединяют в соотношении 16 мг и 0,5 мл соответственно с титром 1 10 по РСК.