ШТАММ КОКСИЕЛЛ COXIELLA BURNETII, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КУ-ЛИХОРАДКИ Российский патент 1995 года по МПК C12N1/00 A61K39/118 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в вакцинно-сывороточном производстве для приготовления инактвивированных вакцин против Ку-лихорадки.

Известен штамм "М-44" - производный итало-греческого штамма "Грита", используемый для изготовления живой вакцины.

Однако в результате длительного пассирования на куриных эмбрионах он находится во втором фазовом состоянии, т.е. утратил некоторые антигенные субстанции, не может вызывать образование антител к антигенам первой фазы коксиелл [1] и обладает значительно менее выраженными протективными свойствами в отношении вирулентных штаммов коксиел по сравнению с коксиеллами, находящимися в первом фазовом состоянии [2], т.е. не может быть использован для приготовления инактивированных вакцин.

Известны зарубежные штаммы коксиелл Бернета "Найн-Майл" и др., однако их пассажная история недостоверна, они многократно пассировались на развивающихся куриных эмбрионах, что приводило к снижению их антигенной активности.

Целью изобретения является получение отечественного штамма, обладающего выраженными протективными свойствами с последующим использованием его для получения инактивированной вакцины против Ку-лихорадки.

Предлагаемый штамм коксиелл Бернета, названный "Луга-1", выделен из внутренних органов мыши Apodemus flavicollis в Ленинградской области. Депонирован во Всесоюзном музее риккетсиальных культур научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР под N 102 от 26 мая 1987 г.

Характеристика штамма
Морфология и культуральные свойства. Коксиеллы находятся в 1-м фазовом состоянии, при окраске по Романовскому-Гимза и Гименеп морфология типичная. Культивируются в развивающихся куриных эмбрионах или в селезенке белых мышей. Наибольшее накопление возбудителя в оболочке желточного мешка при заражении 6-7-дневного куриного эмбриона получают при инфицировании их материалом, содержащим риккетсии в больших концентрациях (+++), в разведении 10^-4 - 10^-5 в объеме 0,4 мл. Минимальная инфицирующая доза для куриных эмбрионов 10^-9.

Патогенные свойства. Штамм обладает выраженной вирулентностью для морских свинок. При внутрибрюшинном заражении морских свинок массой 850-400 г 1,0 мл "яичной" культуры (+++) - минимальная инфицирующая доза равна разведению 10^-10, а минимальная ЛД 10^-8.

Антигенность. Антигенная активность штамма выражена: в ответ на однократное внутрибрюшинное введение кроликам массой 3-3,5 кг 1,0 мл яичной культуры (+++) в разведении 10^-7 - 10^-8, на 7-й день после иммунизации с помощью реакции связывания комплемента (РСК) выявляются антитела к антигену 2-й фазы в титрах 1:20-1:40, а к концу 3-й недели - 1:160-1:320.

Использование штамма для приготовления инактивированной вакцины иллюстрируется следующим примером.

П р и м е р. Куриные эмбрионы заражают разведениями яичной культуры штамма 10^-4 - 10^-5, содержащей по данным метода флуоресцирующих антител (МФА) коксиеллы на (+++) в объеме 0,4 мл. Куриные эмбрионы инкубируют при температуре 37^оС в течение 13 сут. Эмбрионы, павшие до 4-х сут включительно для приготовления антигена не используют. Эмбрионы, павшие на 5-13-е сутки вскрывают и из оболочки желточного мешка каждого эмбриона в отдельности готовят мазки, подвергают обработке МФА и микроскопируют. Эмбрионы, которые по данным МФА содержат коксиеллы не менее чем на два креста и не содержат посторонней флоры (для ее определения каплю содержимого желточного мешка вносят в питательную среду), тщательно гомогенизируют, добавляя физиологический раствор, инактивируют формалином. Затем коксиеллы очищают от тканевых примесей дифференциальным центрифугированием и обработкой эфиром. Полученный корпускулярный антиген лиофильно высушивают, определяют массу, а затем суспендируют в фосфатно-физиологическом буферном растворе (ФБР) рН 7,4. Суспензией антигена (100 мкг/мл) однократно подкожно в объеме 0,5 мл иммунизируют 10 морских свинок массой 350-400 г. Таким образом каждое животное получает дозу антигена равную 50 мкг.

Напряженность иммунитета у вакцинированных животных проверяют через 28-45 сут путем внутрибрюшинного заражения 10000 ИД вирулентной культурой коксиелл Бернета штамма "Хензерлинг" (для объективной оценки протективности штамма в качестве вирулентной культуры использовали гетерологичный, по отношению к заявляемому, штамм) в объеме 1 мл, Оценку иммунитета у вакцинированных животных проводят на основании наблюдений за температурой и местной реакцией в течение 15 сут, а также результатов определения наличия коксиелл в селезенке опытных животных по истечению 6-ти суток после заражения (период максимального накопления коксиелл в этом органе). С этой целью часть животных вскрывают, извлекают селезенку, делают мазки-отпечатки из этого органа и исследуют с помощью МФА.

Установлено, что у всех иммунизированных животных не наблюдалось повышения температуры, местная реакция отсутствовала. При вскрытии 5-ти животных на 6-й день после заражения коксиеллы Бернета в их селезенке не определялись. У всех контрольных (не иммунизированных) животных, зараженных вирулентной культурой в этой же дозе, наблюдалась выраженная лихорадочная реакция продолжительностью не менее 4 дней. На месте введения обнаруживался инфильтрат и на 6-й день после заражения в их селезенке определялось количество коксиелл Бернета.

Для сравнения протективных свойств заявляемого штамма с международным штаммом "Найн-Майл" были поставлены аналогичным образом параллельные опыты. У всех животных иммунизированных 100 мкг антигена наблюдали полный иммунитет в отношении 10000 ИД вирулентной культуры штамма "Хензерлинг".

Иммунизация 50 мкг антигена, приготовленного из штамма "Луга-1" также обеспечивала полный иммунитет, в то же время из 10 животных, получивших такую же дозу антигена, приготовленного из штамма "Найн-Майл", после заражения вирулентной культурой дали лихорадочную реакцию только пять животных, а коксиеллы в селезенке были обнаружены лишь у 50% морских свинок.

Уменьшение иммунизирующей дозы до 10 мкг на животное обеспечивало только частичный иммунитет у животных, однако в этом случае применение антигена, приготовленного из штамма "Луга-1", создавало более эффективную защиту по сравнению с антигеном, приготовленным из штамма "Найн-Майл" (табл.1).

Область использования: микробиология, вакцинно-сывороточное производство, инактивированная вакцина, Ку-лихорадка. Сущность изобретения: новый штамм Coxiella burnetii "Луга-1" НИИЭМ N 102 характеризуется выраженными протективными свойствами и выраженной вирулентностью. Минимальная летальная доза для морских свинок равна 10^-8 минимальная инфицирующая доза 10^-10 Штамм используется для приготовления инактивированной вакцины против Ку-лихорадки. Обеспечивает более эффективную защиту по сравнению с антигеном, приготовленным из штамма "Найн-Майл" 1 табл.

ШТАММ КОКСИЕЛЛ COXIELLA BURNETII, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КУ-ЛИХОРАДКИ.

Штамм коксиелл Coxiella burnetti "Луга-1" НИИЭМ N 102, используемый для получения инактивированной вакцины против Ку-лихорадки.