ПРОИЗВОДНЫЕ ПЕПТИДОВ Российский патент 1997 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям - производным пептидов с антагонистическим к брадикинину действием.

Известны пептиды, обладающие антагонистическим к брадикинину действием, причем L-Pro в положении 7 пептидного гормона брадикинина или другого аналога брадикинина заменен D-аминокислотой, как D-Phe, D-Thi, D-PaI, CDF, D-NaI, MDY, D-Phg, D-His, D-Tyr, D-Trp, D-hPhe, D-VaI, D-Ala, D-His, D-IIe, D-Leu и DOMT /PCT 86/07263/.

В основу изобретения положена задача нахождения новых эффективных пептидов с антагонистическим к брадикинину действием.

Эта задача решается благодаря пептидам формулы I,
H(D)Arg-Arg-C-E-F-K-D Phe(X)OicMArgOH
в которой:
C Pro Hyp Gly, Pro Pro Glu
E Phe, Thia,
F Ser,
K и M простая связь
x H или n-Cl
Причем, если не указано ничего другого, то сокращение аминокислотного остатка без стерео-пометки обозначает остаток в L-форме /см. Schröder, Lübke, The Peptides, том I, Нью-Йорк, 1965, с. XXII XXIII, Губен-Вейл, Методы органической химии, том XV /1 и 2, Штутгарт, 1974/.

Новые пептиды получают следующим образом
а) фрагмент с C-концевой свободной карбоксильной группой или его активированное производное вводят во взаимодействие с соответствующим фрагментом с N-концевой аминогруппой или
б) пептид "строят" постепенно, в полученном по п. /а/ или п. /б/ соединении в случае необходимости одну или несколько введенных временно для защиты других функций защитных групп отщепляют и таким образом полученные соединения формулы I в случае необходимости переводят в их физиологически совместимую соль.

Пептиды настоящего изобретения получают общеизвестными способами химии пептидов, см. например, Губен-Вейл, Методы органической химии, том 15/2, предпочтительно с помощью синтеза в твердой фазе. В качестве α-амино-защитной группы используют уретановые защитные группы, как, например, трет-бутилоксикарбонил/Boc/- или флуоренилметилоксикарбонил/Fmoc/-защитная группа. Если необходимо для предотвращения побочных реакций или для синтеза специальных пептидов функциональные группы в боковой цепи аминокислот дополнительно защищают с помощью пригодных защитных групп /см. например, T.W. Greene "Protective Groups in Organic Synthesis"/, причем в первую очередь используют:
Agr(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtz), Arg(Pmc), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys(4-MeBzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Gly(OBut), His(Tos), His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-Z), Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr(Bzl), Thr(But), Trp(Mts), Trp(CHO), Tyr(Br-Z), Tyr(Bzl) oder Tyr(But) eingesetzt werden.

Твердофазный синтез начинается с терминального углерода пептида с сочетанием защищенной аминокислоты с соответствующей смолой. Такого рода исходные материалы можно получать путем соединения защищенной аминокислоты с модифицированной хлорметильной, оксиметильной, бензгидриламино/BHA/-, метилбензгидриламино /MBHA/-группой полистирольной или полиакриламидной смолой через сложноэфирную или амидную связь. Используемые в качестве материала - носителя смолы имеются в продаже. BHA- и MBHA- смолы обычно используют тогда, когда синтезированный пептид должен содержать на C-конце свободную амидную группу. Если пептид должен содержать вторичную амидную группу на терминальном углероде, то используют хлорметильную или оксиметильную смолу и осуществляют отщепление с помощью соответствующих аминов. Если получают, например, этиламид, то пептид можно отщеплять с помощью этиламина, причем отщепление затем защитных групп боковых цепей осуществляют с помощью других пригодных реагентов. Если в пептиде должны сохраняться трет-бутильные защитные группы аминокислотной боковой цепи, то синтез проводят с помощью Fmoc защитной группы для временной блокировки a-амино-группы аминокислоты при применении методики, описанной, например, R.C. Sheppard, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1982, 587, причем гуанидино-функция аргинина защищается путем протонирования с помощью пиридиний-перхлората, а защита других функционализированных в боковой цепи аминокислот осуществляется с помощью отщепляемых путем каталитического Transfer-гидрирования /A. FeIix и др. J. Org. Chem. 13, 4194 /1978// или с помощью натрия в жидком аммиаке /W. Roberts, J. Am. Chem. Soc. 76, 6203 /1954// бензиловых защитных групп.

После отщепления амино-защитной группы, соединенной со смолой аминокислоты с помощью пригодного реагента, как, например, трифторуксусная кислота в метиленхлориде в случае Boc-защитной группы, или 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде в случае Fmoc-защитной группы, последующие защищенные аминокислоты соединяются последовательно в желательной последовательности.

Промежуточно образующиеся N-терминально защищенные пептидные смолы перед соединением с последующим аминокислотным производным деблокируются благодаря вышеописанным реагентам.

В качестве сочетающего реагента можно применять все возможные, используемые в синтезе пептидов активирующие реагенты, см. например, Губен-Вейл, Методы органической химии, том 15/2, в особенности, однако, карбодиимиды, как, например, N,N'-дициклогексил-карбодиимид, N,N'-диизопропил-карбодиимид или N-этил-N'-/3-диметил-аминопропил/-карбодиимид. Сочетание при этом может проводиться непосредственно путем присоединения аминокислотного производного к активирующему реагенту и в случае необходимости к подвергающейся рацемизации добавке, как, например, I-оксибензотриазол /HOBt/ W. , R.Geiger, Chem. Ber. 103, 708 /1970// или 3-окси-4-оксо-3,4-дигидробензотриазин /HOObt/ /W. R.Geiger. Chem. Ber. 103, 2054 /1970// к смоле, или, однако, можно отдельно осуществлять форактивирование аминокислотного производного в виде симметричного ангидрида или HOBt или HOObt- сложного эфира, и раствор активированного вида в пригодном растворителе наносят на способную к сочетанию пептидную смолу.

Сочетание или активирование аминокислотных производных с одним из вышеуказанных активирующих реагентов можно осуществлять в диметилформамиде, N-метилпирролидоне или метиленхлориде или в смеси вышеуказанных растворителей. Активированное аминокислотное производное обычно используется в 1,5 - 4-кратном избытке. В случаях, в которых происходит неполное сочетание, реакцию сочетания повторяют, не осуществляя предварительно необходимой для сочетания самой ближайшей последующей аминокислоты деблокировки α-аминогруппы пептидной смолы.

Успешное протекание реакции сочетания можно обнаружить с помощью нингидридной реакции, как, например, описано E.Kaiser и др. Anal. Biochem. 34, 595 /1970/. Синтез также можно осуществлять автоматизированно, например, с помощью пептидного синтезатора, модель 430 A фирмы AppIied Biosystems, причем можно применять либо предусмотренные изготовителем прибора программы синтеза, либо, однако, также разработанные самим пользователем программы. Последние используются в особенности при применении защищенных с помощью Fmoc-группы аминокислотных производных.

После синтеза пептидов вышеописанным образом пептид можно отщеплять от смолы с помощью реагентов, как, например, жидкий фторводород /предпочтительно в случае полученных по Boc-методу пептидов/ или трифторуксусная кислота/ предпочтительно в случае синтезированных по Fmoc-методу пептидов. Эти реагенты отщепляют не только пептид от смолы, но и также другие защитные для боковых цепей группы аминокислотных производных. Таким образом получают, кроме того, при применении BHA- и MBHA-смол, пептид в форме свободной кислоты. В случае BHA- или MBHA-смолы получают при отщеплении с помощью фторводорода или трифторметансульфокислоты пептид в виде амида кислоты. Здесь происходит отщепление пептидамидов от смолы путем обработки обычно используемыми в синтезе пептидов средней силы кислотами/ например, трифторуксусной кислотой/, причем в качестве улавливателей катионов добавляются вещества, как фенол, крезол, тиокрезол, анизол, тиоанизол, этандитиол, диметилсульфид, этилметилсульфид, или подобные, обычно в синтезе в твердой фазе улавливатели катионов, индивидуально или в виде смеси двух или более этих вспомогательных средств. Трифторуксусная кислота при этом может применяться также разбавленной другими пригодными растворителями, как, например, метиленхлоридом.

Если должны сохраняться трет-бутильные или бензильные в боковых цепях защитные группы пептидов, то отщепление синтезированных на особым образом модифицированной смоле-носителе пептида осуществляется с помощью 1%-ной трифторуксусной кислоты в метиленхлориде, как, например, описано у R.C. Sheppard, J. Chem. Soc. Chem. Comm, 1982, 587. Если должны сохраняться отдельные трет-бутильные или бензильные в боковых цепях защитные группы, то используют пригодную комбинацию способов синтеза и отщепления.

Для синтеза пептидов с C-терминальной амидной группировкой или w-амино-, соответственно w-гуанидиноалкильной группировкой также применяют модифицированную, описанную Sheppard смолу-носитель. После синтеза полностью защищенный в боковой цепи пептид отщепляют от смолы и затем в классическом синтезе в растворе вводят во взаимодействие с соответствующим амином или W-аминоалкиламином или w-гуанидиноалкиламином, причем в случае необходимости имеющиеся другие функциональные группы можно временно защищать известным образом.

Пептиды согласно настоящему изобретению синтезируются предпочтительно твердофазным методом по двум универсальным тактикам в отношении защитных групп:
синтез осуществляют с помощью автоматического пептидного синтезатора модели 430 А фирмы AppIied Biosystems при применении Boc-, соответственно Fmoc-защитных групп для временной блокировки a-амино-группы.

При применении Boc-защитной группы для синтеза используют запрограммированные изготовителем прибора циклы синтеза.

Синтез пептидов со свободной карбоксильной группой на C-терминальном конце осуществляют на функционализированной соответствующей Boc-аминокислотой 4-/оксиметил/-фенилацетамидометилполистирольной смоле /R.B. Merrifield, J. Org. Chem. 43, 2845 /1978// фирмы AppIied Biosystems. Для получения пептидамида используют MBHA-смолу той же самой фирмы.

В качестве активирующих реагентов служат N,N'-дициклогексилкарбодиимид или N,N'-диизопропилкарбодиимид.

Активирование осуществляют в виде симметричного ангидрида, в виде HOBt - сложного эфира или HOObt сложного эфира в CH₂Cl₂, смеси CH₂Cl₂-ДМФ или NMP. Для сочетания используют 2-4 эквивалента активированного аминокислотного производного. Для случаев, в которых сочетание протекает неполностью, реакцию повторяют.

При применении Fmoc-защитной группы для временной защиты a-амино-группы для синтеза с помощью автоматического пептидного синтезатора модели 430 А фирмы AppIied Biosystems вводят собственную программу синтеза. Синтез осуществляют на смоле на основе п-бензилоксибензилового спирта /S. Wang, J. Am. Chem. Soc. 95, 1328/ 1973// фирмы Bachem, которая этерифицирована по известному способу /E. Atherton и др. J. C. S. Chem. Comm. 1981, 336/ с помощью соответствующей аминокислоты. Активирование аминокислотных производных в виде HOBt- или HOObt-сложного эфира осуществляется непосредственно в поставляемом изготовителем прибора аминокислотном патроне путем добавки раствора диизопропилкарбодиимида в ДМФ к заранее взвешенной смеси из аминокислотного производного и HOBt или HOObt. Также можно использовать полученные в виде вещества Fmoc-аминокислота OObt-сложные эфиры. Отщепление Fmoc-защитной группы происходит с помощью 20%-ного раствора пиперидина в ДМФ в реакционном сосуде. Применяемый избыток реактивного аминокислотного производного составляет 1,5 2,5 эквивалента. Если сочетание прошло неполностью, то его повторяют, как в случае BOC-метода.

Предлагаемые согласно изобретению пептиды индивидуально или в комбинации обладают антагонистическим к брадикинину действием, которое можно испытывать на различных моделях /см. Handbook of Exp. Pharmacol. том 25, изд. Springer, 1970, с. 53 55/, так, например, на изолированной матке крысы, на подвздошной кишке морской свинки.

Для испытания предлагаемых согласно изобретению пептидов на изолированной Arteria pulmonalis, морских свинок /Dunkin Hartley/ весом 400 450 г умерщвляют путем удара по затылку.

Грудную клетку вскрывают и осторожно извлекают Arteria pulmonalis, окрестную ткань тщательно удаляют и Arteria pulmonalis спирально разрезают под углом 45^o.

Полосы сосудов длиной 2,5 см и шириной 3 4 мм фиксируют на вмещающей 10 мл бане для органов, которая заполнена раствором Ringer.

Состав раствора, ммоль/л:
NaCl 154
KCl 5,6
CaCl₂ 1,9
NaHCO₃ 2,4
Глюкоза 5,0
Раствор продувают с помощью 95% O₂ и 5% CO₂ и нагревают до 37^oC. pH-значение составляет 7,4, форнагрузка на полосах сосудов составляет 1,0 г.

Изотонические изменения сокращений охватываются рычажной приставкой и HF-Modem /измеритель пути/ фирмы Hugo Sachs и регистрируются на компенсационном самописце /BEC, Goerz Metrawatt SE 460/.

После 1 часа уравновешивания начинается опыт. После того, как полосы сосудов достигают своей максимальной чувствительности по отношению к 2•10^-7 моль/л брадикинина, брадикинин приводит к сокращению сосудистых полос, можно воздействовать пептидами в дозах 5•10^-8 -1•10^-5 моль/л, смотря по обстоятельствам, 10 минут и после новой дачи брадикинина сравнивает уменьшение воздействия брадикинина по сравнению с контролем.

Для диагностирования частичного агонистического эффекта используют пептиды в дозах 1•10^-5oC 1•10^-3 моль/л.

Рассчитанные из кривых доза-действие IC₅₀ значения предлагаемых в изобретении пептидов указаны в таблице 1.

Все описываемые пептиды относятся к категории нетоксичных соединений.

Терапевтическая полезность предлагаемых в изобретении пептидов охватывает все патологические состояния, которые вызываются, поддерживаются или которым способствуют брадикинин и родственные брадикининам пептиды. Сюда входят, между прочим, травмы, такие как раны, ожоги, сыпи, эритемы, отеки, ангины, артриты, астма, аллергии, риниты, шок, воспаления, низкое кровяное давление, боль, зуд и измененная моторика спермы.

Указанные пептиды формулы I могут использоваться в качестве лечебного средства и фармацевтических препаратов.

Фармацевтические препараты содержат эффективное количество биологически активного вещества формулы I индивидуально или в комбинации вместе с неорганическим, фармацевтически применимым носителем /основой/.

Применение можно осуществлять кишечно, парентерально- как например, подкожно, внутримышечно или внутривенно, подъязычно, накожно, носовым, ректальным путем, внутривлагалищно, внутрибуккально или путем ингаляции. Доза биологически активного вещества зависит от вида теплокровного, веса тела, возраста и от рода применения.

Фармацевтические препараты настоящего изобретения получаются само по себе известными способами растворения, смешения, гранулирования или дражирования.

Для оральной формы применения или для применения на слизистой оболочке активные соединения смешивают с обычными для этой цели добавками, как носители, стабилизаторы или инертные разбавители и обычными способами переводят в пригодные формы введения, как таблетки, драже, разъемные капсулы, водные, спиртовые или масляные суспензии или водные, спиртовые или масляные растворы. В качестве инертных носителей /основ/ можно применять, например, гуммиарабик, глюкозу, стеарилфумарат магния, или крахмалы, в особенности кукурузный крахмал. При этом приготовление можно осуществлять как в виде сухого, так и также в виде влажного гранулята. В качестве масляных носителей или растворителей принимают во внимание, например, растительные или животные масла, как подсолнечное масло и рыбий жир.

Препарат для локального применения может быть в виде водного или масляного раствора, лосьона, эмульсии или желе, мази или жирной мази, или, если возможно, в аэрозольной форме, причем в случае необходимости прилипаемость можно улучшить путем добавки полимера.

Для формы применения в "нос" соединения смешивают с обычными для этой цели добавками, как стабилизаторы или инертные разбавители, и обычными способами приводят в пригодные формы введения, как водные, спиртовые или масляные суспензии или водные, спиртовые или масляные растворы. Водные композиции для введения "в нос" могут содержать в виде добавок хелатообразующие компоненты, этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту, лимонную кислоту, винную кислоту или их соли. Введение растворов для закапывания в нос можно осуществлять с помощью пипетки или капель в нос с повышающей вязкость компонентой, соответственно гелем или кремом для введения в нос.

Для ингаляционного применения могут использоваться распылители или упаковки газа под давлением при применении инертных газов-носителей.

Для внутривенного, подкожного, накожного или интрадермального применения активные соединения или их физиологически совместимые соли в желательном случае вместе с фармацевтическими обычными вспомогательными веществами, например, при изотонировании или установления pH, а также агентами растворения, эмульгаторами или другими вспомогательными веществами растворяют, суспендируют или эмульгируют.

На основании коротких периодов полураспада некоторых из описанных лекарственных веществ в жидкостях организма бессмысленно использование инъекцируемых пролонгированных композиций. В качестве лекарственных форм можно применять, например, масляные суспензии кристаллов, микрокапсулы, стержни или имплантанты, причем последние могут быть построены из совместимых с тканью полимеров, в особенности биоразрушаемых полимеров, как, например, таковые на основе сополимеров поли-молочной кислоты с полигликолевой кислотой или человеческим альбумином.

В качестве пригодной области доз для топического и ингаляционной форм применения пригодны растворы с концентрацией 0,01 5 мг/мл, в случае системных форм применения 0,01 10 мг/кг.

Список сокращений.

Используемые для аминокислот сокращения соответствуют обычному в химии пептидов трехбуквенному коду, который описан в Europ. J. Biochem. 138, 9 /1984/. Дальнейшие используемые сокращения перечислены ниже:
Acm ацетамидометил
e-Ahx ε-аминогексаноил
Aoc цис, эндо-2-азабицикло/3.3.0/-октан-3-S-карбонил
Boc трет.-бутилоксикарбонил
But трет.-бутил
BzI бензил
CDF хлор-/D/-фенилаланил
Cha циклогексилаланил
Chg циклогексилглицил
Ci-Z 4-хлор-бензилоксикарбонил
ДМФ диметилформамид
DOMT O-метил-/D/-треонил
Dnp 2,4-динитрофенил
Fmoc 9-флуоренилметилоксикарбонил
MDY O-метил-/D/-тирозил
Met метил
4-Mebzl 4-метилбензил
Mtr 4-метокси-2,3,6-триметилфенилсульфонил
Mts мезитилен-2-сульфонил
NaI нафтилаланил
NMP N-метилпирролидон
Npg неопентилглицил
Oic цис-эндо-октагидроиндол-2-карбонил
Opr изоксазолидин-3-ил-карбонил
PaI пиридилаланил
Pmc 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил
Tbg трет-бутилглицил
TFA трифторуксусная кислота
Tcs 4-метилфенилсульфонил
Thia 2-тиенилаланил
Tic 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-ил-карбонил
Trt тритил
Следующие примеры должны пояснить предпочтительные способы твердофазного синтеза предлагаемых в изобретении пептидов, причем ими не ограничивается объем охраны изобретения.

Используют следующие производные аминокислот:
Fmoc-Arg(Mtr)-OH, Boc-(D)-Arg-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Hyp-OH, Fmoc-Pro-OObt, Fmoc-Gly-OObt, Fmoc-Phe-OObt, Fmoc-Ser(tBu)-OObt, Fmoc-(D)-Phe-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmos-Aoc-OH, Fmoc-Thia-OH, Fmoc-Opr-OH, Fmoc-(D)-Asn-OH, Fmoc-b-Ala-OH, Fmoc-Oic-OH.

Пример 1.

H-/D/-Arg-Arg-Pro-Hyp-GIy-Phe-Ser-/D/-Phe-Oic-Arg-OH получают последовательно с помощью пептидного синтезатора модели 430 А фирмы AppIied Biosystems при применении Fmos-метода на этерифицированной с помощью Fmoc-Arg/Mtr/-OH смоле на основе п-бензилоксибензилового спирта фирмы Novabiochem /нагрузка примерно 0,5 ммоль /г.смолы/. Используют 1 г смолы и синтез проводят с помощью модифицированной Fmoc-метода программы синтеза.

В патрон синтезатора помещают, смотря по обстоятельствам, 1 ммоль производного аминокислоты со свободной карбаксильной группой вместе с 0,95 ммоль HOObt. Форактивирование этих аминокислот осуществляют непосредственно в патроне путем растворения в 4 мл ДМФ и добавки 2 мл 0,55 М раствора диизопропилкарбодиимида в ДМФ.

HOObt сложные эфиры других аминоксилот растворяют в 6 мл NMP и затем, также, как форактивированные in situ аминокислоты сочетают с предварительно деблокированной с помощью 20% пиперидина в ДМФ смолой. По окончании синтеза пептид при одновременном удалении защитных для боковых цепей групп отщепляют с помощью трифторуксусной кислоты при применении тиоанизола и этандитиола в качестве улавливателей катионов. Полученный после удаления трифторуксусной кислоты остаток многократно настаивают с уксусным эфиром и центрифугируют. Остающийся остаток хроматографируют на ®Сефадексе LH 20 с помощью 10%-ной уксусной кислоты. Содержащие чистый пептид фракции объединяют и подвергают сушке вымораживанием. MS /FAB/:1292,4 /M + H/.

Аналогично примеру 1 дополнительно получены соединения 2 и 3.

Соединение 2:
H(D)Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-(D)Phe-Oic ArgOH
Масс-спектр (бомбардировка быстрыми атомами) 1292,7.

Соединение 3:
H(D)Arg-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-(D)(p-Cl)Phe-Oic ArgOH
Масс-спектр (бомбардировка быстрыми атомами)=1305,0.

Использование: в медицине и биохимии, как соединения, обладающие антагонистическим к брадикинину действием. Сущность: производные пептидов формулы
C = Hyp, Pro, X = H, Cl,
которые получают твердофазным синтезом с помощью пептидного синтезатора модели 430 А фирмы Applied Biosystems при применении Fmoc-метода на этерифицированной с помощью Fmoc-Arg(Mtz)OH смол основе n-бензилоксибензилового спирта. Соединения малотоксичны, их JC 50 = 1,4•10^-8М. 1 з. п. ф-лы, 1 табл.

1. Производные пептидов общей формулы I

где С Pro-Hyp-Gly, Pro-Pro-Gly;
E Phe, Thia;
F Ser;
К и М простая связь;
Х Н, галоид. 2. Производное пептида по п.1, отвечающее формуле
ф