ПОЛИПЕПТИД G 103, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА, ФРАГМЕНТ ДНК HG 103, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД G 103, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHG 103, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД G 103, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА G 103 Российский патент 1995 года по МПК C12N15/48 C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и представляет собой гибридный полипептид, состоящий из полипептида, продукта гена gag вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1) и β-галактозидазы E. coli, синтезируемый бактериальным штаммом E. coli, несущим рекомбинантную плазмиду, имеющую в своем составе клонированный фрагмент гена gag ВИЧ-1 (gag1) слитный с геном β-галактозидазы E. coli, и связывающийся с антителами к продуктам этого гена, что позволяет проводить серодиагностику синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

СПИД возникает в результате заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ при попадании в организм поражает клетки иммунной системы (Т-лимфоциты, моноциты и макрофаги) и клетки центральной нервной системы. Заболевание характеризуется длительным (от 2-х до 10-и лет) бессимптомным периодом, в течение которого в крови инфицированного определяются только антитела к вирусным белкам, затем следует прогрессирующая деградация иммунной и центральной нервной системы. Поэтому для проведения экстренных противоэпидемических, профилактических мероприятий и своевременного начала лечения ВИЧ-инфекции крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять инфицированных ВИЧ на ранних этапах инфекции.

Многочисленные исследования ВИЧ позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. В настоящее время известно два типа вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), имеющих сходную организацию генома и различающихся по антигенной структуре вирусных белков.

ВИЧ имеет наиболее сложное из всех известных ретровирусов строение генома. Помимо генов gag, pol и env, направляющих синтез основных вирионных белков и общих для всех ретровирусов, геном ВИЧ-1 содержит еще шесть генов: vif, tat, rev (или art, или trs), 3'-nef, vpr и vpu. Геном ВИЧ-2, в отличие от ВИЧ-1, не содержит ген vpu, но содержит ген vpx.

Ген gag ВИЧ-1 кодирует три белка мол.м. 24, 17 и 55 кД, p24 p17 и p55, соответственно. Известно, что у человека, зараженного ВИЧ, уже на ранних этапах развития инфекции в крови появляются антитела к антигенным детерминантам продуктов гена gag. Кроме того, поскольку продукты генов gag ВИЧ-1 и ВИЧ-2 имеют общие антигенные детерминанты, эти белки имеют важное диагностическое значение.

Большинство методов диагностики ВИЧ-инфекции основано на определении антител к белкам ВИЧ в сыворотках крови и других биологических жидкостях (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяется принцип иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлюоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антитело-связывающего субстрата рекомбинантных белков ВИЧ, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты ВИЧ, вместо вирусных антигенов не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. Существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов ВИЧ, и в частности гена env.

В настоящее время ведется поиск полипептидов, наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики СПИД. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток продуцентов, так и в направлении выбора наиболее антигеноактивных детерминант и создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов ВИЧ.

Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен оригинальный гибридный полипептид G103, состоящий из продукта фрагмента генома ВИЧ-1 и β-галактозидазы E. coli, связывающий антитела к продукту гена gag ВИЧ-1 и ВИЧ-2; фрагмент ДНК, кодирующий полипептид G103 и входящий в состав рекомбинантной плазмиды pHG103; штамм E. coli ВКПМ N В-5871, содержащий рекомбинантную плазмиду pHG103 и экспрессирующий белок G103.

Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37^оС колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30-32^оС колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре 4-37^оС при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага λ проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30-32^оС.

Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39-42^оС. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага λ составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1 х 10⁸ кл/мл. Белок стабилен при температуре 4^оС в течение 3-4 мес.

Рекомбинантный полипептид G103, выделенный и очищенный из штамма продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к продуктам гена gag ВИЧ-1 в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под N В-5871.

П р и м е р 1. Получение фрагмента ДНК HG103.

У ВИЧ-инфицированного человека отбирают из вены 10 мл гепаринизированной крови, к которой добавляют 30 мл лизирующего раствора (155 мМ NH₄Cl; 10 мМ KHCO₃; 0,1 мм EDTA). Смесь инкубируют 15 мин на льду. Центрифугируют при 2000 G 10 минут при 4^оС. Белые клетки ресуспендируют в 10 мл буфера SE (75 мл NaCl, 2 мМ EDTA), добавляют протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл и 1 мл 20% SDS. Смесь инкубируют 4 ч при 37^оС, добавляют 1/2 объема (5 мл) водонасыщенного фенола и такое же количество хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1). Полученную смесь встряхивают на качалке 15 мин и центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин. К отобранной водной фазе добавляют 1/30 объема NaOAc (рН 5,5) и равный объем изопропилового спирта. ДНК осаждают центрифугированием и промывают 70%-ным раствором этилового спирта. Осадок ДНК растворяют в буфере ТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, рН 8,0) до конечной концентрации 1 мкг/мл.

В эппендорфовскую пробирку на 0,5 мл вносят следующие компоненты: деионизированная вода 43,5 мкл, реакционный буфер 10 мкл 10 х (конечная концентрация 25 мМ Трис-HCl, рН 8,3 (при 25^оС), 50 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 1 мМ β-меркаптоэтанол, желатин 200 мкг/мл), смесь dNTP 16 мкл (конечная концентрация 200 мкМ), праймер N1 5'-GTGTATTATATAATGATC-3' 10 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ), праймер N2 5'-GATCTTCCCTAAAAAATT-3' 10 мкл (конечная концентрация 1,0 мкМ), ДНК (матрица для амплификации) 10 мкл (конечная концентрация 1 нг), Taq полимеразу 0,5 мкл (2,5 единицы на пробу).

Содержимое пробирки перемешивают на вертексе 3-4 с и осаждают на микроцентрифуге в течение 5-10 с.

В пробирку добавляют 50 мкл минерального масла и помещают в аппарат для амплификации ДНК N 801-0177 DNA Thermal Cycler Perkin-Elmer Corporation.

Реакционную смесь инкубируют при 94^оС 7 мин, а затем проводят цикл амплификации со следующими параметрами: 2 мин при 37^оС (гибридизация праймеров), 5 мин при 72^оС (достройка праймеров), 2 мин при 94^оС (денатурация ДНК). Цикл амплификации повторяют 25 раз. После последнего цикла амплификации реакционную смесь инкубируют при 72^оС 10 мин.

В пробирку вносят 50 мкл хлороформа, материал с хлороформом встряхивают 5 с на вертексе, а затем центрифугируют на микроцентрифуге 10 с. Отбирают водную (верхнюю) фазу (около 100 мкл), которая образуется в форме сферической капли, и переносят в чистую пробирку.

10 мкл водной фазы используют для анализа продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле с бромистым этидием (виден фрагмент 1080 п.н.).

Методом Сэнгера определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК HG103
GATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGATATAAAAG
ATACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAATAAGAAAAAAGCAC
AGCAAGCAGCAGCTGACACAGGAAACAGCAGTCAGGTCAGCCAAATTACCCTATAGTGC
AAACATCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGGACTTTAAATGCATGGG
TAAAAGTAATAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTAATACCCATGTTTTCAGCATTGT
CAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAG
CAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGAATAC
ATCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACA
TAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATGACAAATAATCCACCCA
TCCCAGTAGGAGATATTTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAA
TGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAAAAGAACCTTTTAGAGACT
ATGTAGACCGGTTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAAGCTTCACAGGAGGTAAAAAATT
GGATGACAGAAACCTTGTTGGTCCAAAATGCGAACCCAGATTGTAAGACTATTTTAAA A G
CGTTGGGACCAGCGGCTACACTAGAAGAAATGATGACAGCATGTCAGGGAGTAGGAGGAC
CTGGCCATAAGGCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAGCCAAGTAACAAATACAGCTGCCA
TAATGATGCAGAGAGGCAACTTTAGGAATCAAAGAAAGATGGTTAAGTGTTTCAATTGTG
GCAAAGAAGGGCACACAGCCAGAAATTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGCTGTTGGAA A T
GTGGAAGGGAAGGACACCAAATGAAAGATTGTACTGAAAGGCAGGCTAATTTTTTAGGGA
AGATC
П р и м е р 2. Получение плазмиды pHG103.

Синтезированный на ДНК-матрице фрагмент ДНК гидролизуют рестриктазой SauIIIa в буфере для рестрикции (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl и 1 мМ дитиотрейтол рН 7,5) в течение 16 ч при температуре 37^оС.

Фермент инактивируется нагреванием при 70^оС 15 мин. ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл H₂O. 10 мкл обработанного рестриктазами фрагмента ДНК помещают в эппендорфовскую пробирку, содержащую 3 мл лигазного буфера (50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl₂, 20 мМ дитиотрейтол, 1,0 мМ АТФ, 50 мкг/мл бычий сывороточный альбумин), 2 мкл (0,2 мкг/мл) ДНК векторной плазмиды pEL5А, обработанной рестриктазой BamHI и 4 мкл H₂O. К смеси добавляют 1 мкл (100 ед) Т4 ДНК лигазы и инкубируют 3 ч при 16^оС.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E. coli штамм PLT90 по обычной методике. Трансформированные клетки высевают на чашки с 1%-ным LB-агаром, содержащие 25 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами Sma1 и Pst1 и гидролизат исследуют электрофорезом в 1%-ной агарозе.

Гидролизат плазмидной ДНК из рекомбинантного штамма HG103 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 1100 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного нами фрагмента ДНК. При определении нуклеотидной последовательности плазмиды pHG103 установлено, что синтезированный фрагмент гена gag ВИЧ-1 через BamH1 сайт присоединен к 3'-концу гена β-галактозидазы E. coli.

П р и м е р 3. Штамм E. coli HG103, содержащий плазмиду pHG103, выращивают в 100 мл среды LB при 30^оС до плотности 1 х 10⁸. После этого температуру повышают до 37^оС и растят клетки еще в течение 2 ч. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки. Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли. В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры мол.м. 20-160 кД. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E. coli PLT90, содержащий векторную плазмиду pEL5А и не содержащий полученную плазмиду pHG103. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E. coli HG103, содержащий плазмиду pHG103, экспрессирует гибридный полипептид мол.м. 150-160 кД. Этот полипептид назван G103. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида (последовательность β-галактозидазы не представлена), определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента провирусной ДНК ВИЧ-2, следующая:
S L Y N T V A T L Y C V H Q R I D I K D T K E A L D K
I E E E Q N K S K K K A Q Q A A A D T G N S S Q V S Q
N Y P I V Q N I Q G Q M V H Q A I S P R T L N A W V
K V I E E K A F S P E V I P M F S A L S E G A T P Q D
L N T M L N T V G G H Q A A M Q M L K E T I N E E A A
E W D R I H P V H A G P I A P G Q M R E P R G S D I
A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G D I Y K
R W I I L G L N K I V R M Y S P T S I L D I R Q G P K
E P F R D Y V D R F Y K T L R A E Q A S Q E V K N W
M T E T L L V Q N A N P D C K T I L K A L G P A A T L
E E M M T A C Q G V G G P G H K A R V L A E A M S Q V
T N T A A I M M Q R G N F R N Q R K M V K C F N C G
K E G H T A R N C R A P R K K G C W K C G R E G H Q M
K D C T E R Q A N F L G K I слитный с β-галактозидазой E.coli.

П р и м е р 4. Контроль антигенной активности.

Контроль антигенной активности препаратов осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны BH85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24 В, 400 мА в течение 1 ч. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3%-ной TXУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,15 М NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,4) с 0,05% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5% -ного обезжиренного сухого молока, приготовленном на 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 ч при 37^оС обрабатывают сыворотками, содержащими антитела к ВИЧ-1 или ВИЧ-2, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37^оС в течение часа. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1 М трис-HCl, рН 8,0). Анализ показывает, что полипептид Gl03 связывается с антителами к вирусу иммунодефицита человека первого и второго типов.

Таким образом, изобретение позволяет определять антитела к продуктам гена gag ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с высокой эффективностью и специфичностью, а сам процесс определения не требует работы с высокоинфекционным вирусным материалом.

Использование: биотехнология, генная инженерия и иммунология. Сущность изобретения заключается в том, что создан гибридный полипептид G103, состоящий из полипептида продукта гена gag ВИЧ-1 и β -галактозидазы E. coli. Гибридный полипептид синтезируется бактериальным штаммом Escherichia coli ВКПМ N B-5871. Штамм получен в результате трансформации плазмидной ДНК pHG103, несущей фрагмент гена gag ВИЧ-1. 4 с.п. ф-лы.

1. Полипептид G 103, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа, полученный в штамме бактерий Escherichia coli ВКПМ NB-5871, трансформированном рекомбинантной плазмидой pHG103, кодирующей полипептид со следующей аминокислотной последовательностью, приведенной в описании, слитой с β-галактозидазой E. coli, и обладающий способностью связываться с антителами к продукту гена gag ВИЧ-1 или ВИЧ-2, с мол. м. 150 160 килодальтон при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле. 2. Фрагмент ДНК HG103, кодирующей полипептид G103, полученный с помощью цепной реакции полимеризации, с нуклеотидной последовательностью, приведенной в описании,
содержащий на 3′-конце стоп-кодон. 3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHG103, кодирующая полипептид G103, способный связывать антитела к продукту гена gag вируса иммунодефицита человека первого и второго типов размером 7500 п.о. содержащая SmaI SalGI фрагмент ДНК вектора pLM5А, включающий ген β-галактозидазы E. coli, размером 6400 п.о. SmaI SalGI фрагмент ДНК HG103, кодирующий полипептид G103, размером 1100 п.о. по одному участку расщепления рестриктазами SmaI, SalGI, промотор бактериофага лямбда cro LasZ, генетические маркеры, Amp^r-ген устойчивости к ампициллину. 4. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМNB-5871 продуцент полипептида G103, предназначенного для определения антител вирусу иммунодефицита человека первого типа.