ВЕКТОР PEL 5b, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК Российский патент 1995 года по МПК C12N15/70 C12N15/09 

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и может быть использовано для получения плазмид, синтезирующих рекомбинантные белки.

Большие количества рекомбинантных белков можно синтезировать в клетках Escherichia coli, несущих системы экспрессии рекомбинантных белков на основе промотора фага лямбда. Транскрипция в таких системах регулируется связыванием температурочувствительного репрессора фага лямбда, кодируемого мутантным геном clts857, с операторным участком. Когда клетки растут при температуре 30-32^оС, репрессор связывается с оператором и блокирует экспрессию. При повышении температуры роста до 42^оС репрессор инактивируется, что позволяет РНК-полимеразе связываться с промотором и начать транскрипцию гена. В результате интенсивной транскрипции и последующей трансляции могут синтезироваться значительные количества белка.

Известны рекомбинантные плазмидные ДНК pEX1,pEX2 и pEX3, позволяющие экспрессировать рекомбинантные белки во всех трех рамках считывания. Последовательности ДНК для экспрессии можно вставить в полилинкер, расположенный в 3'-конце гена lacZ. В указанных плазмидах P_R промотор бактериофага лямбда обеспечивает экспрессию последовательностей ДНК, и продукт составляет значительную часть суммарного бактериального белка. Экспрессируемый белок в клетке накапливается в виде водонерастворимых аггломератов. Однако у этих векторов есть недостаток: для выделения водонерастворимых аггломератов рекомбинантного белка необходимо разрушать клеточную стенку бактерии.

Вектор pEX2 выбран в качестве прототипа для получения вектора pEL5b. Преимущество заявленного вектора pEL5b заключается в том, что в результате использования оперона, состоящего из гена, кодирующего рекомбинантный белок, и гена лизоцима одновременно с синтезом рекомбинантного белка идет синтез лизоцима, разрушающего полисахаридную оболочку E.coli, что существенно упрощает очистку водонерастворимых аггломератов рекомбинантного белка.

Сущность изобретения состоит в том, что сконструирован вектор pEL5b размером 6,4 тысячи пар оснований (т.п.о.), состоящий из следующих элементов.

Xba1-Xba1- фрагмента плазмидной ДНК бактериального вектора pEX2 размером 5,8 т. п. о. который содержит слитный cro-lacZ ген, кодирущий слитный белок под контролем промотора P_R бактериофага лямбда, полилинкер в 3'-конце lacZ-гена:
BamH1-BamH1- фрагмента ДНК плазмиды pLysS, содержащего ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющего размер 0,6 т.п.о.

Для конструирования плазмиды pEL5b ДНК плазмиды pEX2 гидролизуют рестриктазой XbaI и достраивают по три нуклеотида в липких концах с помощью ДНК-полимеразы PollK. Параллельно получают BamH1 рестрикт размером 0,6 т.п. о. из плазмиды pLysS, содержащий ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющий три достроенных с помощью PollK нуклеотида в липких концах. Фрагмент pEX2 лигируют с фрагментом ДНК, содержащим ген лизоцима бактериофага Т4. Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli, содержащие в хромосоме температурочувствительный ген бактериофага лямбда clts857, например клетки штамма PLT90. Трансформанты высевают на среду с ампициллином при 30^оС. Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42^оС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа, происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду pEL5b. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА при -20^оС.

П р и м е р 1. Получение векторной плазмиды pEL5b с оперонной системой экспрессии и лизиса.

Клетки бактерий E.coli PLT90, содержащие плазмиду pEX2, выращивают в 50 мл бульона 2YT (16 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л воды), содержащего 100 мкг/мл ампицллина до титра 10⁹ кл/мл.

Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 2 мл раствора (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 5 мг/мл лизоцима) и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Далее добавляют 4 мл раствора 0,2 М NaOH, 1% -ного додецилсульфата натрия, перемешивают, инкубируют 10 мин во льду, добавляют 3 мл охлажденного 5 М раствора ацетата калия, рН 4,8, перемешивают, оставляют на 10 мин во льду, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропилового спирта и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, ресуспендируют в 0,5 мл ТЕ8-буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и добавляют равный объем насыщенного раствора ацетата натрия. После инкубации в течение 30 мин при минус 20^оС осадок удаляют центрифугированием, а к надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропанола и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, промывают 70%-ным этанолом и ресуспендируют в 100 мкл ТЕ8-буфера.

Плазмидную ДНК (1 мкг pEX2) обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Xba1 (10 ед.) в буфере A (50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотрейтол, 100 мМ NaCl, 4 мМ спермидина) в течение 2 ч.

Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Используя фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E.coli достраивают три из четырех нуклеотидов в липких XbaI-концах. Белки удаляют фенольной экстракцией, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл ТЕ8.

Для получения фрагмента ДНК с геном лизоцима проводят рестрикцию 10 мкг ДНК плазмиды pLysS рестриктазой BamH1. С помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli достраивают три из четырех нуклеотидов в липких BamH1-концах. Фрагмент -BamH1-BamH1- с частично достроенными липкими концами размером 0,6 т. п. о. выделяют с помощью электрофореза сорбцией на бумагу ДЕ81. Бумагу промывают, инкубируют 30 мин при 80^оС в буфере 2 М ацетата натрия, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА. ДНК, перешедшую в раствор, удаляют с бумаги центрифугированием, к раствору добавляют 2 объема этанола. После инкубации при -20^оС в течение 1 ч осадок собирают центрифугированием и растворяют в 5 мкл буфера ТЕ8.

0,5 мкг фрагмента ДНК вектора pEX2 смешивают с 0,2 мкг ДНК, содержащей ген лизоцима бактериофага Т4. Соединение фрагментов проводят с помощью 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в буфере: 30 мМ трис-HCl, рН 7,2, 10 мМ хлористого магния, 2 мг/мл желатины, 1 мМ спермидина, 0,1% меркаптоэтанола, 0,2 мМ АТФ при 20^оС в течение 2 ч.

Полученной смесью трансформируют клетки E.coli PLT90 содержащие clts857 репрессор. Для этого ночную культуру клеток разводят средой LB с 10 мМ MgSO₄ в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до плотности А550 0,3 ОЕ. После 15 мин охлаждения при 0^оС клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 1/3 первоначального объема буфером 30 мМ ацетата калия, рН 5,8, 100 мМ RbCl, 50 мМ MnCl₂, 10 мМ CaCl₂, 15% глицерина, и оставляют на 30-60 мин на льду. Клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в 1/12,5 первоначального объема в буфере 10 мМ MOPS, рН 6,8, содержащем 10 мМ RbCl, 75 мМ CaCl₂, 15% глицерина и инкубируют 15 мин на льду. К суспензии клеток добавляют лигированные фрагменты ДНК, инкубируют 40 мин при 0^оС, затем 2 мин при 34^оС, 2-3 мин при 0^оС, разбавляют в 5 раз средой 2YT, растят 30 мин, при 30^оС и высевают на агаризованную среду 2YT с ампициллином (50 мг/мл).

Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42^оС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду pEL5b. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА при -20^оС.

П р и м е р 2. Использование вектора pEL5b для получения рекомбинантных белков в виде водонерастворимых аггломератов.

Клетки PLT90, содержащие плазмиду pEL5b, инокулируют в 1 мл среды LB с 100 мкг/мл ампицилина и растят ночь при 30^оС. Ночную культуру разводят в 2 мл этой же среды в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до 0,2 ОЕ при 550 нм, затем повышают температуру до 42^оС для индукции синтеза слитного белка и растят еще 2 ч. Затем добавляют хлороформ до 1% и инкубируют при 37^оС еще час. Далее лизат центрифугируют, ресуспендируют осадок в 75 мкл буфера ТЕ8 и добавляют равный объем буфера для электрофореза (160 мМ трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 4% додецилсульфата натрия, 4 мМ ЭДТА, 6% меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего). Клеточные белки анализируются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли. После окончания электрофореза белки в геле фиксируют и окрашивают кумасси ярко-голубым R-250.

Анализ полученных результатов показывает, что в результате действия лизоцима происходит разрушение оболочки бактерии и высвобождение водорастворимых клеточных бактерий в среду, что проявляется в ослаблении минорных белковых полос. В контроле, в случае использования плазмиды pEX2, такого эффекта нет.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать водонерастворимые аггломераты рекомбинантных белков без использования дополнительных методов разрушения клеточных стенок.

Изобретение относится к биотехнологии в частности к генетической инженерии, и может быть использовано при создании плазмид и соответствующих штаммов-продуцентов рекомбинантных белков, а также для очистки белковых продуктов. Преимущество заявленного вектора pEL5b заключается в том, что в результате использования оперона, состоящего из гена, кодирующего рекомбинантный белок, и гена лизоцима, одновременно с синтезом рекомбинантного белка идет синтез лизоцима, разрушающего полисахаридную оболочку E. coli, что существенно упрощает очистку водонерастворимых агломератов рекомбинантного белка.

ВЕКТОР PEL 5b, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК, размером 6,4 т.п.о. содержащий Xba1 Xba1-фрагмент плазмидной ДНК бактериального вектора pEX2 размером 5,8 т.п.о. со слитным cro lacZ-геном, кодирующим белок под контролем промотора P_R бактериофага лямбда, полилинкер в 3' - конце lacZ-гена; BamH1 BamH1-фрагмент ДНК плазмиды PLysS, с ген лизоцима бактериофага Т4 размером 0,6 т.п.о. уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК на 3'-конце гена lacZ: EcoR1, Sma1, BamH1, Sal1, Pst1; - оператор O_R и промотор P_R бактериофага лямбда; терминаторы транскрипции фага fd; генетический маркер устойчивость к ампициллину; - спектр хозяев бактерии Escheri chia coli, с геном clts 857 бактериофага лямбда.